2017 Fiscal Year Research-status Report
線維症疾患特異的マクロファージSatM前駆体の探索による分化系譜の改編
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17K19557
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐藤 荘 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (60619716)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 疾患特異的マクロファージ / 線維症 / 細胞分化 / 自然免疫 / 疾患 / アレルギー / メタボリックシンドローム / 創薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マクロファージの前駆体であるMDPを移植しても、末梢でのSatMが得られなかった。一方で、その一つ上流の前駆体集団であるGMPを移植したところ、分化したSatMが末梢でも観察された。したがって、SatMはMDPを介さずにGMP依存的に分化していると考えた。そこで、GMPが更にいくつかのサブグループに分類するためにGMP中のサブグループの中でSatM前駆体を含む集団を分類するマーカーを探索した。その前駆体は骨髄中のSatMが発現しているマーカーと共通の物を一部発現しているという仮定の下、骨髄中のSatMのマーカーを網羅的に探索した結果、これまでのマーカーに加え更に、FceRIやC5aR等が得られた。そこでこれらのマーカーを用いてGMPを分類した所、３つの分画に分けることができた。その中でもFceRI+ly6C-GMPを生体内に戻してfate mappingを行ったところ、末梢にSatMが得られた。さらにそのGMPの下流でSatMの前駆体に当たる細胞を探索した所、linease-ckit-C5aR+FceRI+Ly6C-CD115+で表される集団の形態が核が２核様になっており、末梢のSatMと似ていることが分かった。そこで、この集団を生体内に戻してfate mappingを行ったところ末梢にSatMが得られたことから、これがSatMの前駆体（SatM progenitor (SMP)）であることが分かった。
野生型及びNF-IL6-/-マウス由来のSMPの遺伝子発現を比較した所、KOではcell deathに関わるpathwayに異常があることがわかった。以上の事から、NF-IL6がSMPで機能することにより、SatMが分化し、そしてこの細胞が線維化に寄与することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまでの実験は研究室にあるBD社製のFACS機器を使用していたために、一度に染色できる細胞表面マーカーの数が少なく、前駆体の様な生体内に非常に少ない割合でしか存在しない細胞集団の解析が難しかった。しかし、導入したサーモフィッシャー社のAttune NxTを用いた細胞の解析が可能になり、このため一度に解析できる細胞表面マーカーの数が2倍になり、解析が非常にしやすくなった。これまで1種類と考えられてきたGMPがさらに複数に分かれることが本研究から明らかとなった。さらに、その中でもSatMの前駆体が出現するGMPの亜集団が存在していること、また、GMPの下流にあるSMPがSatMの前駆体であることを明らかにした。NF-IL6-/-マウスでは末梢ではSatMが消失しているために、この分子の作用点は前駆体にあると推測していた。SMPでの網羅的な遺伝子発現パターンを解析した所、MDP、GMPではNF-IL6欠損下でも異常は見られなかったが、SMPでは野生型と比較してその発現パターンが著しく異なっていたことから、NF-IL6の作用点はSMPであることが明らかとなった。このように、これまでそれほど多くないと考えられていた末梢の免疫細胞やその前駆体は、現在考えられている以上に亜集団に分けられると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
SatMは線維化期に肺に遊走することがこれまでの研究で明らかになっている。11.7TのMRIを用いた生体イメージング技術を活用し、病態の進行に伴って起こるSatMの遊走能の可視化を試みる。申請者らは既に炎症部位及び線維化部位を造影剤を用いずにMRIにて可視化することに成功している。また、鉄ナノ粒子を細胞に取り込ませることにより、細胞の遊走をも可視化可能である。そこで、この技術を応用してSMPの線維化部位への遊走能を可視化することにより、病態における細胞の挙動を追う。CD45.2＋由来SMPをガンマ線照射したCD45.1＋マウスに移入して分化させ、そのマウスから分化したCD45.2＋SatMを回収し鉄ナノ粒子で標識したものを、線維化を起こした野生型マウスに再度移植することにより、疾患部位に集積するかを検討する。この評価系により、SMPが分化した際に遊走能もSatMと同等であるかを検討する。
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| Causes of Carryover |
前駆細胞同定の為のFACS解析を行う際に、これまでは1つのサンプルに対して多数のマーカーを染色・解析することができなかったために、解析に使用するマウスの匹数が非常に多くなってしまっていた。しかし、導入したサーモフィッシャー製のAttune NxTを用いて細胞の解析を行った場合、一度に解析できる細胞表面マーカーの数がこれまでの約2倍になったために、細胞のマーカー情報を一度に多く入手することができるようになった。このように効率的に実験を行う事が可能となって、実験に使用するマウスの数が減らすことができたために、消耗品費を減らすことができた。初年度に節約できた研究費は、今年度以降の研究計画に記載しているSMPを生体内で分化させて得たSatMの線維化部位輸送能の実験に使用する予定である。
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