Development of methodology for in situ genomic analysis

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19558
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 飯田 哲也 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90221746)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 微生物ゲノム / メタゲノム / 生物多様性

Outline of Annual Research Achievements

深海を含む地球環境には、いまだ同定されていない微生物が無数存在している。また、ヒト臨床検体において、形態学的には微生物らしきものが組織中に観察されるが培養や核酸の検出ができず正体が不明なケースがある。本研究では、電子顕微鏡により観察される微生物の遺伝情報を獲得するための方法論を構築することを目的とする。また、方法論が確立した後に、深海由来およびヒト臨床由来の試料を用いて、試料中に存在する微生物の遺伝情報の解析を行い、それらの遺伝情報について明らかにする。具体的には、微生物様構造の存在を確認した電子顕微鏡観察用の超薄切片から核酸を抽出し、そのドラフトゲノム配列を決定するまでのプロトコールの開発を目指す。
本年度の実績
電子顕微鏡観察用に微生物を包埋した樹脂からの微生物ゲノムの回収のための条件検討を、モデル生物としての酵母に加え、環境から採集した微生物を用いて行った。通常、透過型電子顕微鏡による観察にはサンプルをオスミウムアセトン液等で固定するが、微生物核酸への影響を考慮し、エタノール、アセトン等での固定を試み、核酸回収効率を検討し最適な方法を決定した。回収効率の検討は、酵母のITS領域および細菌のrRNA遺伝子領域に対する定量PCRにより行った。回収される微生物核酸は微量であることが想定されるので、最終的にドラフトゲノム解析にまでもっていくためは、回収核酸の増幅が必要である。いくつかの全ゲノム増幅法を検討することにより、回収核酸を次世代シークエンス解析にまでもっていくために最適な増幅法を決定した。また、超薄切片からの微生物核酸の回収方法について検討を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

モデル生物としての酵母に加え、環境から採集した微生物を用いて電子顕微鏡観察用に微生物を包埋した樹脂からの微生物ゲノムの回収のための条件検討についてはほぼ目標を達成した。包埋試料からの微生物ゲノム回収について、ほぼ条件を決定できた。また全ゲノム増幅法のプロトコールも決定した。平成29年度に海洋由来試料の入手はできたが、電子顕微鏡観察用のサンプル調製法の条件検討に時間を要し、平成30年度内に当初の計画であった海洋由来試料のゲノム解析を行うに至らなかった。また、解析を行う海洋由来試料に関してはすでに入手ができているが、今後のさらなる研究のために追加の入手が必要である。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度に海洋由来試料の入手はできたが、電子顕微鏡観察用のサンプル調製法の条件検討に時間を要し、平成30年度内に当初の計画であった海洋由来試料のゲノム解析を行うに至らなかった。サンプル調製法については今年度至適条件を決定できたので、補助事業期間を延長して来年度、当初計画の海洋由来試料のゲノム解析を行ないたい。

Causes of Carryover

平成29年度に海洋由来試料の入手はできたが、電子顕微鏡観察用のサンプル調製法の条件検討に時間を要し、平成30年度内に当初の計画であった海洋由来試料のゲノム解析を行うに至らなかった。サンプル調製法については平成30年度に至適条件を決定できたので、補助事業期間を延長して平成31年度に当初計画の海洋由来試料のゲノム解析を行ないたい。