ブースター不要で強力な抗HIV活性を有するプロテアーゼ阻害剤の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19577
• Research Institution: National Center for Global Health and Medicine
• Principal Investigator: 満屋 裕明 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 研究所長 (20136724)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: ウイルス / HIV-1 / プロテアーゼ阻害剤 / CYP3A4 / 薬物動態

Outline of Annual Research Achievements

Darunavir(DRV)に代表される HIV-1 プロテアーゼ阻害(PIs)は、強力な抗 HIV効果を発揮する一方、肝臓でCYP3A4によって迅速に代謝される為、ritonavir (RTV) や cobicistat (COBI) 等のブースターと呼ばれるCYP3A4阻害剤と併用する必要がある。しかし、boosterの使用は(1)血中の中性脂質の増加を引き起こし血管障害や心疾患等のリスクを高め、(2)HIV-1感染以外の合併症を持つ患者に使用する際、抗HIV-1剤以外の治療薬との併用による副作用が重篤化し抗HIV-1剤の服薬の中止を余儀なくされる危険性があるなどの問題を生じる。そこで、本研究ではboosterを使用することなく生体内で有効血中濃度を長期間維持、1週間 又は１か月に1回の投与で強力な抗HIV-1効果を発揮する新規PIsの開発を目的とする。
平成29年度は、human liver microsome (HLM) を用いてin vitroの試験においてCYP酵素による代謝を受けにくい化合物を同定する事に成功した。また、同定した化合物の構造活性相関を調べることで、新しくデザイン・合成した化合物(GRL-105及び-120)が、CYP耐性を有する事を明らかにした。更にこれらの化合物はRTVやCOBIといったboosterに比べ肝細胞内の中性脂質増加などの副作用が軽減される可能性を示唆する結果を得た。また、ある種の修飾でDRV耐性を有する多剤耐性HIV-1変異株に対する化合物の抗HIV-1活性が上昇する事も示した。GRL-120とDRV耐性HIV-1由来のプロテアーゼの結晶構造解析の結果、GRL-120がプロテアーゼのフラップ領域にあるアミノ酸、Gly48と水素結合を形成しており、この結合がDRV耐性HIV-1変異株に対する抗ウイルス活性に重要である事が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究ではboosterを使用することなく生体内で有効血中濃度を長期間維持、1週間 又は１か月に1回の投与で強力な抗 HIV-1効果を発揮する新規PIsの開発を目的とする。
当初の計画では、研究の全期間内に (1) CYP酵素に耐性を有する化合物の同定、(2)化合物の構造とCYP耐性の相関の検討、(3)得られたCYP耐性の化合物を基にした誘導体の合成・開発、(4)有望な化合物の薬物動態をマウス又はラットを用いて検討、(5)CYP酵素に対する耐性機序の解明といった5項目を検討する予定であった。上述の様に平成29年度は、過去に我々が新たにデザイン・合成したHIV-1プロテアーゼ阻害剤 (PIs) の中から、CYPに対する耐性を有する化合物群の同定に成功、構造活性相関を検討する事でalkylamino基が修飾されたTp-THF構造がCYP酵素に対する耐性に重要な役割を果たす事を明らかにした。また、一定の化学的修飾が化合物のDRV耐性を有する多剤耐性HIV-1変異株に対する活性の増加に関与する事を明らかにした。過去の研究により一定の修飾基がCYPの活性中心である鉄イオン (Fe) と結合、不活化する事でCYPを阻害するという作用機序機序が提唱されているが、本研究で得られたCYP耐性PIsもCYPの活性を阻害する事から同様の作用機序であることが予測される。本研究の全期間を通じて達成すべき5項目の内、既に第一項、第二項及び第五項を達成しており、更に第三項も現在進行形で合成・同定が進んでいる事から平成29年度の研究進度は100%以上であると評価している。一方で、今回同定したCYP耐性PIsはCYP酵素によって分解を受けにくいだけでなく、CYP酵素の活性を阻害する機能を有している事が示唆されており、DDIsの原因となる可能性が示された。この問題に関しては平成30年度の研究課題とする。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は、平成29年度と同様に新規化合物の合成・開発を行う。平成29年度の研究成果から生じた問題点を克服する為に、CYP酵素の活性を阻害する事無く、1週間又は1か月に1度の投与で十分な抗ウイルス活性を発揮できる化合物の同定を目指す。具体的な化合物の設計方針を下記に示す。
近年、化合物をフッ素化する事で生体内での薬物動態や標的タンパク質への結合能が向上する事が報告されている。フッ素化に伴う主な作用は3つ存在するとされており、 (1) 代謝による薬剤の不活性化を遅延させ服薬回数を減らす、(2) 化合物の脂溶性を向上、細胞膜透過性を増大させ、良好なoral bioavailability (経口吸収率) が得られる傾向があるといった利点の他に (3) フッ素が標的タンパク質との相互作用を形成する事で、化合物の親和性を向上させるとされている。また、cyclopropyl 基を化合物に導入する事で、活性、選択性、脳移行性、代謝に対する安定性などの向上と、副作用の低減効果が報告されている。平成30年度は、平成29年度に同定された複数の新規化合物に上記の置換基を導入する事によりCYP耐性を有し、HIV-1野生株だけでなく多剤耐性HIV-1変異株にも高い抗ウイルス活性を発揮する化合物の同定を試みる。同時に、得られた化合物がCYP酵素の活性を阻害しない事を確認する。また、HepG2細胞を用いて各化合物が細胞内の中性脂質の増減に及ぼす影響も検討する。有望な化合物が得られた場合、平成29年度と同様に作用機序の解析を行い、ラットによるin vivo薬物動態試験を行う事を予定している。

Research Products

• [Journal Article] Design of Highly Potent, Dual-Acting and Central-Nervous-System-Penetrating HIV-1 Protease Inhibitors with Excellent Potency against Multidrug-Resistant HIV-1 Variants. (2018)
  • Author(s): Ghosh AK, Rao KV, Nyalapatla PR, Kovela S, Brindisi M, Osswald HL, Sekhara Reddy B, Agniswamy J, Wang YF, Aoki M, Hattori SI, Weber IT, Mitsuya H.
  • Journal Title: Chem Med Chem., Volume: 13(8) Pages: 803-815
  • DOI: 10.1002/cmdc.201700824.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mechanism of Darunavir (DRV)'s High Genetic Barrier to HIV-1 Resistance: A Key V32I Substitution in Protease Rarely Occurs, but Once It Occurs, It Predisposes HIV-1 To Develop DRV Resistance. (2018)
  • Author(s): Aoki M, Das D, Hayashi H, Aoki-Ogata H, Takamatsu Y, Ghosh AK, Mitsuya H.
  • Journal Title: MBio. Volume: 9(2) Pages: -
  • DOI: 10.1128/mBio.02425-17.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] HIV-1 with HBV-associated Q151M substitution in RT becomes highly susceptible to entecavir: structural insights into HBV-RT inhibition by entecavir. (2018)
  • Author(s): Yasutake Y, Hattori SI, Hayashi H, Matsuda K, Tamura N, Kohgo S, Maeda K, Mitsuya H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 8(1) Pages: 1624
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19602-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GRL-079, a novel P2-Tp-THF-C5-alkylamine- and P2' -Abt-containing HIV-1 protease inhibitor, is extremely potent against multi-drug-resistant HIV-1 variants including HIVDRVRp51 and has a high genetic barrier against the emergence of resistant variants. (2018)
  • Author(s): Delino NS, Aoki M, Hayashi H, Hattori SI, Chang SB, Takamatsu Y, Martyr CD, Das D, Ghosh AK, Mitsuya H.
  • Journal Title: Antimicrob Agents Chemother. Volume: 62(5) Pages: e02060-17
  • DOI: 10.1128/AAC.02060-17.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design and Development of Highly Potent HIV-1 Protease Inhibitors with a Crown-Like Oxotricyclic Core as the P2-Ligand To Combat Multidrug-Resistant HIV Variants. (2017)
  • Author(s): Ghosh AK, Rao KV, Nyalapatla PR, Osswald HL, Martyr CD, Aoki M, Hayashi H, Agniswamy J, Wang YF, Bulut H, Das D, Weber IT, Mitsuya H.
  • Journal Title: J Med Chem. Volume: 60(10) Pages: 4267-4278
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.7b00172.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design of novel HIV-1 protease inhibitors incorporating isophthalamide-derived P2-P3 ligands: Synthesis, biological evaluation and X-ray structural studies of inhibitor-HIV-1 protease complex. (2017)
  • Author(s): Ghosh AK, Brindisi M, Nyalapatla PR, Takayama J, Ella-Menye JR, Yashchuk S, Agniswamy J, Wang YF, Aoki M, Amano M, Weber IT, Mitsuya H.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem. Volume: 17 Pages: 30731-9
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2017.04.005.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GRL-09510, a Unique P2-Crown-Tetrahydrofuranylurethane -Containing HIV-1 Protease Inhibitor, Maintains Its Favorable Antiviral Activity against Highly-Drug-Resistant HIV-1 Variants in vitro. (2017)
  • Author(s): Amano M, Miguel Salcedo-Gomez P, Yedidi RS, Delino NS, Nakata H, Venkateswara Rao K, Ghosh AK, Mitsuya H.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 7(1) Pages: 12235
  • DOI: 10.1038/s41598-017-12052-9.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design, synthesis, X-ray studies, and biological evaluation of novel macrocyclic HIV-1 protease inhibitors involving the P1'-P2' ligands. (2017)
  • Author(s): Ghosh AK, Sean Fyvie W, Brindisi M, Steffey M, Agniswamy J, Wang YF, Aoki M, Amano M, Weber IT, Mitsuya H.
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Lett. Volume: 27(21) Pages: 4925-4931
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2017.09.003.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel central nervous system-penetrating protease inhibitor overcomes human immunodeficiency virus 1 resistance with unprecedented aM to pM potency. (2017)
  • Author(s): Aoki M, Hayashi H, Rao KV, Das D, Higashi-Kuwata N, Bulut H, Aoki-Ogata H, Takamatsu Y, Yedidi RS, Davis DA, Hattori SI, Nishida N, Hasegawa K, Takamune N, Nyalapatla PR, Osswald HL, Jono H, Saito H, Yarchoan R, Misumi S, Ghosh AK, Mitsuya H.
  • Journal Title: Elife Volume: 6 Pages: e28020
  • DOI: 10.7554/eLife.28020.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design, Synthesis, Biological Evaluation, and X-ray Studies of HIV-1 Protease Inhibitors with Modified P2' Ligands of Darunavir. (2017)
  • Author(s): Ghosh AK, Fyvie WS, Brindisi M, Steffey M, Agniswamy J, Wang YF, Aoki M, Amano M, Weber IT, Mitsuya H.
  • Journal Title: ChemMedChem. 2017 Volume: 12(23) Pages: 1942-1952
  • DOI: doi: 10.1002/cmdc.201700614
  • Peer Reviewed
• [Presentation] P2-Tp-THF-C5-alkylamine and P'2-Abt contribute to the potency of newly-generated protease inhibitors against a wide spectrum of HIVMDRS including HIVDRVRP51 (2017)
  • Author(s): Nicole S. Delino, Manabu Aoki, Hironori Hayashi, Haydar Bulut, Shin-ichiro Hattori, Simon B. Chang, Yuki Takamatsu, Cuthbert D. Martyr, Debananda Das, Arun K. Ghosh, and Hiroaki Mitsuya,
  • Organizer: 第27回抗ウイルス療法学会学術集会・総会
• [Presentation] P1-phenylにフッ素原子を導入したHIVプロテアーゼ阻害剤は強力な抗ウイルス活性を発揮する (2017)
  • Author(s): 服部真一朗、林宏典、青木学、Debananda Das、青木宏美、鍬田伸好、高松悠樹、Yedidi Ravikran、長谷川和也、Arun K Ghosh、前田賢次、満屋裕明
  • Organizer: 第27回抗ウイルス療法学会学術集会・総会
• [Presentation] GRL-079, a novel P2-Tp-THF-C5-alkylamine- and P2’-Abt-containing HIV-1 protease inhibitor, is extremely potent against a wide spectrum of HIVMDRs including HIVDRVRp51 with a high genetic barrier against the emergence of resistant variants, (2017)
  • Author(s): Nicole S. Delino, Manabu Aoki, Hironori Hayashi, Shin-ichiro Hattori, Simon B. Chang, Yuki Takamatsu, Cuthbert D. Martyr, Debananda Das, Arun K. Ghosh, and Hiroaki Mitsuya,
  • Organizer: 第19回白馬シンポジウムin仙台
• [Presentation] 多剤耐性HIV変異株に対して強力な抗ウイルス活性を発揮する新規HIVプロテアーゼ阻害剤、GRL-001～004の同定と構造・活性相関 (2017)
  • Author(s): 服部真一朗、林宏典、青木学、長谷川和也、青木宏美、鍬田伸好、Haydar Bulut、Debananda Das、前田賢次、Arun K. Ghosh、満屋裕明
  • Organizer: 第19回白馬シンポジウムin仙台
• [Presentation] GRL-079, a novel P2-Tp-THF-C5-alkylamine- and P2’-Abt-containing HIV-1 protease inhibitor, is extremely potent against a wide spectrum of multi-drug-resistant HIVs including HIVDRVRp51 and has a high genetic barrier against the emergence of resistant variants (2017)
  • Author(s): Nicole S. Delino, Manabu Aoki, Hironori Hayashi, Shin-ichiro Hattori, Simon B. Chang, Yuki Takamatsu, Cuthbert D. Martyr, Debananda Das, Arun K. Ghosh, and Hiroaki Mitsuy
  • Organizer: 第18回熊本エイズセミナー
• [Presentation] GRL-079, a novel P2-Tp-THF-C5 alkylamine and P2’-Abt-containing HIV-1 protease inhibitor, is extremely potent against a wide spectrum of HIVMDRs, including HIVDRVRp51, with a high genetic barrier against the emergence of resistant variants. (2017)
  • Author(s): Nicole S. Delino, Aoki Manabu, Hayashi Hironori,Hattori Shin-ichiro, Simon B. Chang, Takamatsu Yuki, Cuthbert D. Martyr, Debananda Das, Arun K. Ghosh, and Mitsuya Hiroaki,
  • Organizer: 第31回日本エイズ学会学術集会・総会
• [Presentation] 多剤耐性HIV変異株にも強力な抗ウイルス活性を発揮する新規HIVプロテアーゼ阻害剤の同定 (2017)
  • Author(s): 服部真一朗、林宏典、青木学、長谷川和也、Haydar Bulut、Debananda Das、Arun Ghosh、満屋裕明,
  • Organizer: 第31回日本エイズ学会学術集会・総会