2017 Fiscal Year Research-status Report
膵癌オルガノイドライブラリの構築による膵癌発癌機構の解明
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17K19612
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
清野 隆史 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (10649940)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | 膵癌 / オルガノイド / Wnt / GATA6 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新たに20例の膵癌オルガノイドを樹立し、これまでに樹立していた20例と合わせて40例の膵癌オルガノイドによるライブラリーを作製した。このライブラリーの全サンプルに対してエキソームシーケンス、染色体コピーナンバー解析、遺伝子発現マイクロアレイ解析を施行し、網羅的に膵癌オルガノイドの遺伝学的情報を収集するとともに、オルガノイドの長期的な細胞増殖能を維持するために必要な種々のニッチ因子の要求性を検討した。その結果、膵癌オルガノイドはWntとRspondinという２つのニッチ因子の要求性に応じて３つのサブタイプに分けられることが明らかとなった。すなわち、①WntとRspondinのいずれも必要とするタイプ（Wnt非分泌型）。②Wntは自己分泌し、Rspondinのみを必要とするタイプ（Wnt分泌型）。③WntとRspondinのいずれも必要としないタイプ（Wnt/Rspondin非依存型）である。網羅的遺伝子発現解析、および予後付き公開データの解析から、この３つのサブタイプは段階的に悪性化していることが明らかとなり、加えてメチル化マイクロアレイ解析の結果、その背後では転写因子GATA6の発現量が低下していることが判明した。実際、shRNAを用いたGATA6のノックダウンにより、Wnt非分泌型膵癌はWnt分泌型膵癌に変化し、反対に、GATA6の過剰発現により、Wnt分泌型膵癌はWnt非分泌型に変化した。一方で、正常膵管オルガノイドに、CRISPR/Cas9システムを用いて膵癌に代表的な４つの遺伝子（KRAS, CDKN2A, TP53, SMAD4）の変異を導入することで、人工膵癌オルガノイドを作製することに成功した。この人工膵癌オルガノイドは、Wnt非存在下で培養すると著しく増殖が抑制されるが、徐々にその環境に適応し、Wnt分泌型へ変化することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膵癌はWntとRspondinという２つのニッチ因子に対する非依存性を獲得しながら、段階的に悪性化することが明らかとなり、その根底には転写因子であるGATA6の発現が密接に関わっていることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Wnt非分泌型からWnt分泌型への移行はGATA6という１つの遺伝子の発現で説明が可能であるが、Wnt分泌型からWnt/Rspondin非依存型への移行は他の複数の転写因子が関与している可能性がある。遺伝子発現マイクロアレイのデータから、Wnt/Rspondin非依存型となるために必要と考えられる候補遺伝子を20種類程度選択し、sgRNAライブラリーを作製する。これをレンチウイルスを用いて人工膵癌オルガノイドにトランスフェクションし、WntとRspondinが不要となったオルガノイドでノックアウトされた遺伝子を解析する。この手法により膵癌が段階的に悪性化する際に関わっている複数の転写因子を同定する。そして、Wnt/Rspondin非依存型膵癌は免疫不全マウスの脾臓移植により、他のタイプではみられない肝転移をすることがわかっているので、膵癌肝転移の仕組みについても探求する。
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