2017 Fiscal Year Research-status Report
CRISPR-Cas9 based screening for essential tumor suppressors in liver carcinogenesis
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17K19625
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
山本 雄介 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (60768117)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 潤太郎 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (60464864)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がんゲノム配列の解読によりドライバー変異とそれによって引き起こされるゲノム不安定性の産物であるパッセンジャー変異とに選別されており、ドライバー変異は腫瘍形成に直接関与すると推定されている。しかし、そのように同定された新規ドライバー候補の多くは綿密な機能解析は行われておらず実際はどの程度、腫瘍形成に寄与するのかは不明なのが現状である。また、単独ではなく複数の変異の組合せによって発がん作用を発揮する可能性もあり、これもドライバー変異の包括的な機能解析を阻んでいる要因とされる。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な肝幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損および変異を導入する。それによって正常の細胞から発がんを誘導することで、ドライバー変異の機能評価をする。ドライバー変異の機能解析結果から肝がん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。まずは、実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子を現時点ではそのまま使用予定である。現時点では、CRISPR/Cas9が機能する条件の最適化を行っており、実際の機能解析に移行する段階である。さらに遺伝子欠損を誘導した細胞を免疫不全動物に移植し、発がんの過程を検証するシステムを構築中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、培養した初代細胞にCRISPR/Cas9で欠損や一塩基多型を導入する条件の最適化や変異を導入する遺伝子の選択、ガイドRNAのデザインを実施し、実験システムの構築を行った。実験システムの最適化に時間を要し、実際の細胞のがん化の誘導やそれらの免疫不全動物への移植において、十分な結果を得ることができていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9による遺伝子変異誘導系を確立し、発がんに寄与するドライバー遺伝子の機能解析を実施する。それらの組合せによって、より発がんに寄与する遺伝子変異の組合せを同定する実験系の構築を進める。また、in vitroおよび免疫不全動物を用いたin vivoでの遺伝子変異の組合せによる多段階発がんモデルの構築を行う。これらの結果から肝臓の発がんに実質的に寄与する遺伝子変異の機能解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
CRISPR/Cas9の最適化を図るために平成29年度と同様にIn vitro系におけるCRISPR/Cas9の遺伝子変異導入実験に必要なA分子生物学実験試薬と細胞培養関連試薬が必要と判断した。同定される変異の機能を解析するため、in vitroでのアッセイ系の確立、組合せの効率的なスクリーニングシステムの確立、免疫不全マウスへ移植実験系を作成し、計画した実験を遂行する。
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[Presentation] Serum microRNAs for the early-stage detection of hepatocellular carcinoma.2017
Author(s)
Juntaro Matsuzaki, Shunsuke Kondo, Minoru Esaki, Takuji Okusaka, Kazuaki Shimada, Ken Kato, Yoshiaki Aoki, Makiko Ichikawa, Satoko Takizawa, Hiromi Sakamoto, Shumpei Niida, Fumitaka Takeshita, and Takahiro Ochiya
Organizer
Cold Spring Harbor Asia “Liver Biology, Diseases &Cancer”
Int'l Joint Research
