2018 Fiscal Year Research-status Report

CRISPR-Cas9 based screening for essential tumor suppressors in liver carcinogenesis

Research Project

Project/Area Number	17K19625
Research Institution	National Cancer Center Japan
Principal Investigator	山本雄介国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 主任研究員 (60768117)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松崎潤太郎国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (60464864)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2020-03-31
Keywords	上皮細胞 / がん抑制遺伝子 / CRISPR-Cas9 / 多段階発がん
Outline of Annual Research Achievements	大規模ながんに対する次世代シーケンシング解析の結果から、遺伝子の変異はドライバー変異とそれによって引き起こされるゲノム不安定性の産物であるパッセンジャー変異とに選別されており、ドライバー変異は腫瘍形成に直接関与すると推定されている。しかし、そのように同定された新規ドライバー候補の多くは綿密な機能解析は行われておらず実際はどの程度、腫瘍形成に寄与するのかは不明なのが現状である。また、単独ではなく複数の変異の組合せによって発がん作用を発揮する可能性もあり、これもドライバー変異の包括的な機能解析を阻んでいる要因とされる。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な上皮幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損を導入する。それによって、既知のがん抑制遺伝子だけでなく、統計的に有意にがんの発生に関与していることが明らかなものの、その発がん過程での寄与率が不明瞭な遺伝子の機能解析を組織ごとにすることで、新規がん抑制遺伝子の機能的な同定をすることさらに、それらの組合せによって多段階的に進展していく発がん過程を再現することを目的としている。ドライバー変異の機能解析結果からがん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子の解析だけでなく、他組織に対する遺伝子にも標的を広げ、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子抑制実験を実施している。さらに遺伝子欠損の組合せによる多段階発がんの実験も同時並行で行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初予定していた、肝臓がんに対する遺伝子だけでなく、より顕著な表現型を確認することができる肺の上皮細胞を用いた検討にも着手しており、そちらの検討でより良好な結果が得られたため、CRISPR-Cas9を用いてがん抑制遺伝子を抑制し、肺の腺がん細胞の源と考えられている小気道上皮細胞、および肺の扁平上皮がんの元と考えられている肺の気管上皮細胞に対して、CRISPR-Cas9で遺伝子の抑制を行うことで、細胞ごとのがん抑制遺伝子の差や発がんへの寄与率を比較検討することが可能になり、より多くの情報を得ることが可能になると期待されたため、そちらの検討も行っている。これらの実験で、同時にがんの元となる細胞の再検証も可能になり、多段階発がんに関与する遺伝子の組合せの同定も同時に進めている。そのため、当初の予定よりもやや遅れている。しかしながら、それらの実験結果は当初予定していたものよりも、重要かつ多くの発がんに対する知見を得られることが強く期待でき、そちらに方向転換することに大きな意義があると申請者は考えている。
Strategy for Future Research Activity	対象とする細胞の種類を増やしたことによって、CRISPR-Cas9で抑制する遺伝子群は変更になったが、研究の手技的には大きな変化はない。細胞ごとに遺伝子を抑制していき、細胞の増殖率の変化を検証すること、さらには組合せによって、発がんに実質的に寄与する遺伝子およびその組合せの探索を細胞ごとに進めていく。細胞が発がんに至るまでの遺伝子変異の組合せを同定することで、それらを段階的に導入し、多段階的な発がん過程を再現すること、ならびに細胞が浸潤能や転移能を有する上での必須な遺伝子の組合せを網羅的に同定することで、これまでの大規模ながんゲノム解析データから得られた情報を実験的に検証していく。
Causes of Carryover	対象とする細胞の種類を増やしたことによって、CRISPR-Cas9で抑制する遺伝子を変更して、標的とする遺伝子数を増加させたため、2019年度まで予算の繰り越しをしました。そのため、次年度使用額が生じました。