2017 Fiscal Year Research-status Report
母体低栄養と胎仔視床下部GABA-Clシステム変調による脳の発達障害機序の解明
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17K19682
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2019-03-31
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| Keywords | 発達障害 / 低栄養 / 胎児脳 / ストレス / 視床下部 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1．母体低栄養胎仔における既知・新規HPA軸反応標識系の確立：AgRP-mCitrineマウスとCRH-GCaMP3マウスを交配し、AgRP細胞選択的にmCitrineを、CRH細胞選択的にGCaMP3を発現するマウス（AgRP-mCitrine/CRH-GCaMP3）を作製した。成獣の摂餌制限を行い、弓状核のAgRP細胞（mCitrine）と室傍核のCRH細胞（GCaMP3）でc-fosの発現が上昇していることを免疫組織化学法で確認した。また、室傍核スライス標本を作製し、CRH細胞からグラミシジンパッチクランプやCa2+測定ができることを確認した。
２．遺伝子改変マウスへの母体低栄養負荷モデルの作製：WNKによるKCC2リン酸化部位変異導入（疑似持続リン酸化）マウス(KCC2 T906E-T1007E)の継代繁殖に成功した。AgRP細胞選択的にGABA合成を欠失したマウス（AgRPCre/+-mCitrine/GAD67flox/flox）を作製するための、GAD67flox/floxマウスを入手し、繁殖に取り掛かった。母体低栄養モデルでは摂餌制限（-30%）を妊娠10.5-18.5日に行い、胎生期低栄養マウスモデルを作成した。野生型でも出生体重が有意に低下することを確認した。モデルマウス胎仔でAgRP細胞（mCitrine）、CRH細胞（GCaMP）の胎生期での発生を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既知・新規HPA軸反応標識系の確立はAgRP-mCitrineマウスとCRH-GCaMP3マウスを交配し、AgRP細胞選択的にmCitrineを、CRH細胞選択的にGCaMPを発現するマウスを作出し、交付申請書に記載した「研究の目的」どおりに達成した。しかし、母体低栄養モデルでは、まずは非妊娠成獣での既知・新規HPA軸の低栄養への反応の確認を先行させたので、妊娠個体への負荷は次年度行う。母体低栄養／胎仔視床下部GABA-Clシステム変調モデルの準備として、KCC2 T906E-T1007Eマウスを確立し、胎生期低栄養マウスモデルの作製にも着手しているので、全体としては、おおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．遺伝子改変マウス胎仔脳の神経細胞の発生・移動の解析：AgRP-mCitrine/CRH-GCaMP3マウス胎仔でのc-fos発現を野生型と比較し、母体低栄養が胎仔GABAシステムを介して新規HPA軸と既知HPA軸に与える影響を確認する。AgRP-mCitrineマウス、CRH-GCaMP3マウスとVGAT-tdTomato tgマウスホモを交配し、Alexa-EdUによる細胞分裂アッセイを用い、脳室帯での皮質板細胞の発生（Alexa）、内側線条体原基でのGABA細胞の発生（Alexa/tdTomato）、第三脳室周辺でのAgRP細胞（Alexa/mCitrine）、CRH細胞（Alexa/GCaMP）の発生と続いて起こるこれらの細胞の移動を、GABAA受容体、グルココルチコイド受容体、CRH受容体との共存と移動の過程も含め評価する。
２．母体低栄養／胎仔視床下部GABA-Clシステム変調モデルの解析：母体の低栄養の有無と仔のGAD67遺伝子ヘテロ欠損の有無の4群で脳組織を回収し、RRBS法で、次世代シーケンサー（成育医療センター）を用いて網羅的DNAメチル化解析を行う。モデルの出生後は里親に飼育させ、生後8週齢で社会的行動、認知機能、衝動性・注意機能、感覚運動系機能などの行動解析による評価を行う。また、脳波を記録してγ帯成分をパワースペクトラムで解析する。さらに評価終了後に屠殺し、１．で確認した影響の成長後を、視床下部、内側前頭皮質、大脳新皮質、海馬・扁桃体などの辺縁皮質で確認する。以上から、精神疾患病態フェノタイプとの整合性を評価する。
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| Causes of Carryover |
計画では物品費￥1,750,000・旅費￥350,000・その他￥200,000を計上し、成果発表と研究打合せにそれぞれ旅費がかかることを想定していたが、学会での成果発表の際に併せて研究打合せも行ったため、当初予定額よりも旅費が抑えられた。次年度使用額については、主に消耗品費や旅費として利用する。また、現在実験に使用している現有備品が老朽化しており、もしも不具合が生じて実験の遂行に支障が生じた場合は、その修理もしくは代替品の購入に要する費用の一部とする。
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[Journal Article] Biallelic Variants in CNPY3 , Encoding an Endoplasmic Reticulum Chaperone, Cause Early-Onset Epileptic Encephalopathy2018
Author(s)
Mutoh H, Kato M, Akita T, Shibata T, Wakamoto H, Ikeda H, Kitaura H, Aoto K, Nakashima M, Wang T, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Kakita A, Miyake K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
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Journal Title
The American Journal of Human Genetics
Volume: 102
Pages: 321-329
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] De novo variants in CAMK2A and CAMK2B cause neurodevelopmental disorders2018
Author(s)
Akita T, Aoto K, Kato M, Shiina M, Mutoh H, Nakashima M, Kuki I, Okazaki S, Magara S, Shiihara T, Yokochi K, Aiba K, Tohyama J, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Ogata K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
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Journal Title
Annals of Clinical and Translational Neurology
Volume: 5
Pages: 280-296
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex.2017
Author(s)
Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S., Fukuda, A.
Organizer
The 17th Hamamatsu-Kyungpook Joint Medical Symposium
Int'l Joint Research
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[Presentation] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes perturbs GABAergic neurogenesis, GABAergic synapse formation and behavioral phenotypes.2017
Author(s)
Fukuda, A. Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T. and Hata, K.
Organizer
Neuroscience 2017
Int'l Joint Research
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[Presentation] Constitutive phosphomimetic inhibition of KCC2 at Thr906/Thr1007 causes GABA-dependent network excitability, seizure, and early postnatal death.2017
Author(s)
Watanabe, M., Duan, J., Mansuri, M., Zhang, J., Fukuda, A. and Kahle, K.T.
Organizer
Neuroscience 2017
Int'l Joint Research
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[Presentation] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex.2017
Author(s)
Sinha Adya, S., Hosoi, Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
Organizer
第64回中部日本生理学会
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[Presentation] Taurine depletion reduces postsynaptic GABAA receptors in layer 2/3 pyramidal neurons of the somatosensory cortex.2017
Author(s)
Hosoi, Y., Akita, T., Watanabe, M., Mutoh, H., Miyajima, H. and Fukuda, A.
Organizer
XXIII World Congress of Neurology（WCN2017）
Int'l Joint Research
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[Presentation] Regulation of inwardly rectifying potassium current by WNK3 kinase in layer V pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex.2017
Author(s)
Sinha Adya, S., Hosoi,Y., Sohara, E., Mutoh, H., Akita, T., Uchida, S. and Fukuda, A.
Organizer
第40回日本神経科学大会
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[Presentation] Prenatal stress on Gad1-heterozygotes selectively perturbs parvalbumin (PV)-positive GABAergic neurogenesis, GABA synapses and social interaction behavior.2017
Author(s)
Wang, T., Sinha Adya, S., Yanagawa, Y., Kawai, T., Hata, K. and Fukuda, A.
Organizer
IBNS 26th Annual Meeting
Int'l Joint Research
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