変形性関節症の新規診断法リキッドバイオプシーの開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19727
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大月 孝志 岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802) ; 臼井 真一 岡山大学, 保健学研究科, 准教授 (50346417) ; 稲垣 純子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (90271056)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2019-03-31
• Keywords: 遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

変形性関節症は整形外科領域では最も頻度の高い疾患であり、我が国の潜在的な患者速く３３００万人と推定されているが、適切な早期診断法がない。近年、がんの診断分野において「リキッド・バイオプシー」が注目されている。リキッド・バイオプシーは少量の血液や尿などで実施できるため（１）低侵襲 （２）早期診断 （３）ゲノム解析による治療薬選択 など多くの利点が報告されており世界中の研究機関や医療機器メーカーが開発に乗り出している。しかし骨・関節領域でのリキッドバイオプシーは我々の知る限り臨床応用例がない。果たして、変形性関節症のリキッドバイオプシーは実現できるのであろうか？この命題に答えを出すために、本研究では変形性関節症へのリキッドバイオプシーに挑戦することを計画した。
まず、ラットに膝関節の前十字靭帯及び内側側副靭帯を切離し、内側半月板を切除した変形性関節症手術モデルを作成した。変形性関節症手術の施行前および作成１０日後、２週間後、４週間後、６週間後にそれぞれ関節液および末梢血液の採取を行った。得られた関節液および血漿成分からエクソソームを含む小胞成分を精製した。小胞成分の粒子径を測定したところエクソソームが含まれていることが確認された。次にエクソソーム中に含まれているRNA成分を定量した。関節液はスタート時の採取量が少ないこともあって微量のＲＮＡしか検出できなかったのに対し、血液中のエクソソームに含まれるＲＮＡは一定量存在することが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

血液中に含まれている分泌された小胞内にエクソソームが存在していることが確認され、リキッドバイオプシーに利用できる可能性が示唆された。現在、エクソソーム内に含まれているRNAを網羅的に解析する準備を進めている。一方で関節液は手術後早期にラット膝関節から得られる量が当初想定していたよりも少なく関節内腔へ、リン酸緩衝液を注入して洗い出す方法など試みたが生体内に吸収される成分が多く回収量は増えないことが明らかとなった。これら初年度に得られた結果より、本実験系では血液に比べて関節液を用いる方法ではエクソソームの回収量が少なく直接的な比較ができないと結論づけることができた。

Strategy for Future Research Activity

ラット血液中に含まれるエクソソームを使ってリキッドバイオプシーができるかに挑むのが当初の目的であるので、回収できたエクソソーム内に変形性関節症に特異的なmicroRNAなどが含まれているかを探索することが最大の目標である。そのために、エクソソーム内に含まれるRNAを望来的に解析する方法をとる必要があると考えている。コントロールとして正常ラットもしくはシャム手術施行ラットの血液から回収したエクソソーム内に含まれるmicroRNAと比較することを予定している。発現量が微量な為に次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を行うことを計画している。
そもそも本研究では、ヒト変形性関節症での早期診断にリキッドバイオプシーで実現可能かどうかを目的としているために、関節液が大量に存在する進行期の変形性関節症を対象としていない。これらの点も鑑みて、関節液と血液での直接比較よりも血液単独での解析を順次進め、候補となるＲＮＡ配列が抽出された段階で関節での発現を検討する方針を選択することとした。

Causes of Carryover

当該年度の実験実施にあたっては消耗品を節約することで使用額を抑えることができた。
また、次年度に次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を予定しており、解析費用が高額になることが予測されたために次年度使用額へと移すこととした。

Research Products

• [Journal Article] Host-produced ADAMTS4 Inhibits Early- Stage Tumor Growth. (2018)
  • Author(s): Asano K, Edamatsu M, Hatipoglu OF, Inagaki J, Ono M, Ohtsuki T, Oohashi T, Hirohata S.
  • Journal Title: Acta Med. Okayama. Volume: 72（3） Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Differences in activated clotting time and initial heparin dosage during atrial fibrillation ablation for patients with edoxaban compared with warfarin. (2018)
  • Author(s): Yamaji H, Murakami T, Hina K, Higashiya S, Kawamura H, Murakami M, Kamikawa S, Hirohata S, Kusachi S.
  • Journal Title: J Cardiovasc Electrophysiol. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/jce.13483.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A High-Fat and High-Cholesterol Diet Induces Cardiac Fibrosis, Vascular Endothelial, and Left Ventricular Diastolic Dysfunction in SHRSP5/Dmcr Rats. (2018)
  • Author(s): Watanabe S, Kumazaki S, Kusunoki K, Inoue T, Maeda Y, Usui S, Shinohata R, Ohtsuki T, Hirohata S, Kusachi S, Kitamori K, Mori M, Yamori Y, Oka H.
  • Journal Title: J Atheroscler Thromb. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.5551/jat.40956.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Stromal Versican Regulates Tumor Growth by Promoting Angiogenesis. (2017)
  • Author(s): Asano K, Nelson CM, Nandadasa S, Aramaki-Hattori N, Lindner DJ, Alban T, Inagaki J, Ohtsuki T, Oohashi T, Apte SS, Hirohata S.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 7(1) Pages: 17225
  • DOI: 10.1038/s41598-017-17613-6.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Circulating adipocyte fatty acid-binding protein is a predictor of cardiovascular events in patients with stable angina undergoing percutaneous coronary intervention. (2017)
  • Author(s): Takagi W, Miyoshi T, Doi M, Okawa K, Nosaka K, Nishibe T, Matsuo N, Hirohata S, Ito H.
  • Journal Title: BMC Cardiovasc Disord. Volume: 17(1) Pages: 258
  • DOI: 10.1186/s12872-017-0691-2.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 癌微小環境におけるVersicanおよびADAMTSによる分解産物の分布様式 (2018)
  • Author(s): 廣畑 聡
  • Organizer: 第27回プロテオグリカンフォーラム グルコサミノグリカン/プロテオグリカン（GAG/PG）研究の最前線
• [Presentation] The Peculiar Factor Contributed to the Occurrence of Adverse Events Related to Use of Tolvaptan in Congestive Heart Failure Cases. (2018)
  • Author(s): Yuichi Kato, Kazuna Hayashi, Misao Hasegawa, Naoaki Matsuo, Takashi Fujiwara, Masafumi Tanimoto, Kenzo Kagawa, Yukari Nakano, Nobuhiko Ohnishi, Atsushi Takaishi, Satoshi Hirohata, Masayuki Ueeda
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会
• [Presentation] A Trend of Increase in TG and Omega-3 PUFAs was Observed in All Age Groups of Patients with AMI. (2018)
  • Author(s): Takashi Fujiwara, Yukari Nakano, Kazuna Hayashi, Yuichi Kato, Misao Hasegawa, Naoaki Matsuo, Masafumi Tanimoto, Kenzo Kagawa, Nobuhiko Ohnishi, Atsushi Takaishi, Satoshi Hirohata, Masayuki Ueeda.
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会
• [Presentation] The Clinical Pathway with Early Administration of Tolvaptan was Useful and Safe Even in Super-Elder Patients with Congestive Heart Failure. (2018)
  • Author(s): Naoaki Matsuo, Kazuna Hayashi, Yuichi Kato, Misao Hasegawa, Takashi Fujiwara, Masafumi Tanimoto, Kenzo Kagawa, Nobuhiko Ohnishi, Satoshi Hirohata, Masayuki Ueeda, Atsushi Takaishi.
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会
• [Presentation] Supplementation of Omega-3 PUFAs to Patients with IHD Still Improved Their Long-term Prognosis in Strong Statin Era. (2018)
  • Author(s): Naoaki Matsuo, Kazuna Hayashi, Yuichi Kato, Misao Hasegawa, Masafumi Tanimoto, Kenzo Kagawa, Yukari Nakano, Nobuhiko Ohnishi, Satoshi Hirohata, Masayuki Ueeda, Atsushi Takaishi.
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会
• [Presentation] Hospitalization Period could be Significantly Shortened by the Clinical Pathway with Early Administration of Tolvaptan in Congestive Heart Failure Cases. (2018)
  • Author(s): Yuichi Kato, Kazuna Hayashi, Misao Hasegawa, Naoaki Matsuo, Masafumi Tanimoto, Takashi Fujiwara, Kenzo Kagawa, Yukari Nakano, Nobuhiko Ohnishi, Atsushi Takaishi, Satoshi Hirohata, Masayuki Ueeda
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会
• [Presentation] ApoE-rich HDL in pre-heparin plasma may be HDL remnants which remain in the circulation. (2017)
  • Author(s): Usui S, Shinohata R, Miyashita K, Hirohata S, Shibakura M, Fukamachi I, Nakajima K.
  • Organizer: 67th AACC annual scientifi meeting & clinical lab expo.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] SHRSP5/Dmcr rats fed on high-fat and high-cholesterol diet develop non-alcoholic steatohepatitis that aggravates cardiac or vascular dysfunction (2017)
  • Author(s): Shota Kumazaki, Katsuhiro Kusunoki, Terumi Inoue, Yui Maeda, Satoshi Hirohata, Hisao Oka, Shogo Watanabe.
  • Organizer: The 6th International Congress on Lipid & Atherosclerosis 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Uric acid aggravates cardiac inflammation via adipocyte URAT-1 in non-alcoholic steatohepatitis. (2017)
  • Author(s): Shota Kumazaki, Katsuhiro Kusunoki, Terumi Inoue, Yui Maeda, Satoshi Hirohata, Hisao Oka, Shogo Watanabe
  • Organizer: The 6th International Congress on Lipid & Atherosclerosis 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 炎症性サイトカイン誘導性マトリックス分解酵素発現のイオンチャネルを介した抑制とその機構解析 Inflammatory cytokine-induced matrix degrading enzymes expression were attenuated by mechanical stress through transient receptor potential cation channel (2017)
  • Author(s): 大月孝志、品岡 玲、品岡 加苗、Cilek Mehmet、Hatipoglu Omer、西村 拓人、稲垣 純子、西田 圭一郎、廣畑 聡
  • Organizer: 2017 年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）
• [Presentation] SHRSP5/Dmcrラットを用いた非アルコール性脂肪性肝炎と心血管傷害の仲介因子とし ての胆汁酸代謝 (2017)
  • Author(s): 熊崎章太、佐々木駿、田頭里菜、中村茉由、丸山望美、廣畑 聡、渡邉彰吾
  • Organizer: 第50回日本動脈硬化学会総会・学術集会