2018 Fiscal Year Research-status Report
破骨細胞をモデルとしたリン脂質動態による細胞融合制御機構の解明
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17K19737
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
入江 敦 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主任研究員 (10280786)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、破骨細胞分化における膜脂質動態に焦点を当て、分化過程における破骨細胞の融合・多核化の機構の解明に取り組んでいる。現在までのところ、破骨細胞の融合過程において、PE輸送トランスポーター・ABCB4とABCG1による細胞膜上のPE局在変化と、脂質合成酵素・LPEAT2によるPEの生合成増加が必須であることを明らかにしている。
これらの成果に引き続き、リン脂質代謝酵素の一種・sPLA2-XIIAが、破骨細胞形成、ならびに破骨細胞により重篤化する関節炎発症に関わる可能性を新たに見出し、本酵素と破骨細胞形成・関節炎発症のメカニズムの解明を目的としている。
また、細胞融合は破骨細胞に限らず特定の細胞種に観察される特異的かつ重要な生命現象であることから、破骨細胞融合で観察された脂質動態が、他の細胞融合現象にも関わるか否かという疑問は、生命化学の基礎研究の観点から興味深い命題である。そこで我々は、骨髄細胞から分化・融合する、多核マクロファージについて解析したところ、融合期に細胞膜外層のPEは増加するものの、その増加の度合いは破骨細胞融合に比べて弱いことを明らかにした。さらにABCG1の遺伝子発現が上昇し、この分子が多核マクロファージ形成に関わる可能性があるものの、破骨細胞のような脂質動態と細胞融合の明確な関係性を見出すことはできなかった。今後は他の細胞融合系である筋芽細胞融合についても解析を進める予定である。
さらに、関節炎発症について、我々が見出した脂質動態分子群の核酸医薬による治療法の開発を見据えた応用研究を、本年度新たに開始した。現在のところ基礎的知見の段階ではあるが、核酸医薬siRNAの有効な安定化方法を見出すことに成功し、特許出願を行った。以上のように、破骨細胞融合と脂質動態分子を基にして、基礎研究から応用研究まで枝葉を広げて新しい展開を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度までの研究により、リン脂質の合成酵素の一種であるsPLA2-XIIAが、破骨細胞形成や関節炎発症に関わる可能性を見出している。本年度の研究で、リコンビナントsPLA2-XIIAの酵素活性を測定したところ、高度不飽和脂肪酸を含有するPEを基質にする傾向が強いことが明らかとなった。また、sPLA2-XIIAを破骨細胞前駆体に過剰発現すると破骨細胞の融合多核化が促進されることを見出した。これらの結果と、我々が既に見出している破骨細胞形成にPEの局在変化や高度脂肪酸合成が必須であるという知見との関連を今後明らかにする必要がある。
また、我々が見出した破骨細胞を分化誘導する脂質関連分子について、関節炎治療に応用することが最終的な大きな目標となる。脂質関連分子を治療に応用できないかと模索していたところ、当初は予定していなかったことではあるが、siRNAを用いて脂質関連分子を発現制御することによって新奇関節炎治療法を開発できるのではないかと思い立った。本年度新たにsiRNA医薬品を研究している有機化学者と共同研究することとなり、関節炎への応用を目指し、手始めとして彼らが新奇合成したsiRNA安定化化合物のin vitroの生化学的な物性を解析した。その結果、この化合物とsiRNA化学修飾を組み合わせることにより、生体内で極めて不安定なsiRNAが飛躍的に安定化することを見出し、特許出願した。この結果は申請時の計画とは若干方向性が異なるものの、骨疾患における脂質関連分子をターゲットとした治療法の開発という観点からは新しい一歩であり、比較的進捗状況が良かったので、本年度はこの内容で学会発表を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までの研究に引き続き、破骨細胞以外の細胞融合現象における脂質動態の責任分子の同定を来年度も進め、筋芽細胞融合過程における脂質動態分子の解析を行う。これらの解析により、種々の細胞融合過程において共通の脂質動態機構が働いているか否か明らかにする予定である。
次に、sPLA2-XIIAの解析を進める。sPLA2-XIIA欠損マウスにおいて、関節炎モデル実験を施行し、足の腫脹や炎症マーカー発現などの関節炎病態をスコアリングし、この病態モデルにおける炎症マーカーの発現を解析し、病態モデルにおける脂質動態分子の役割を明らかにしていく。
続いて、破骨細胞融合期において偽足様突起同士が接触することが、破骨細胞融合に必須であることを既に研究代表者は見出しているので、破骨細胞融合過程における偽足様突起形成を担う分子の探索を行う。既存の突起形成への関与が知られている分子に重点を置き、遺伝子発現解析を行うことにより突起形成の候補遺伝子を探索し、脂質動態による膜の構造変化がもたらす破骨細胞の機能的変化を明らかにする。
最後に、昨年度に引き続き、脂質動態分子のsiRNA医薬品への応用に向けた基礎的研究を行う。昨年度、特許出願した内容について、国内優先権主張出願や国際特許出願に向けて追加実験を行う。さらに、将来的な関節炎へのin vivoにおけるsiRNA適用のために、関節炎に関わる滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞前駆細胞といった細胞にin vitroでsiRNA/安定化化合物複合体を作用させて挙動を解析する。
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| Causes of Carryover |
昨年度の使用額が当初予定より少なく、本年度に繰り越した額が大きかったため、本年度の支出額が多かったものの、両年度の支出総額としては計上額を下回り、次年度に繰り越すことになった。旅費に関しては、学会発表旅費や研究打合せの旅費を科研費以外の研究費から支出したために、当初予定していた国内旅費の支出がなかった。
来年度は、本年度に引き続きマウスから初代培養細胞を単離し、培養するための関連試薬、培養細胞を用いた細胞生物学的な解析のための試薬を購入する。また、遺伝子発現解析のために、リアルタイムPCRといった分子生物学的な試薬類の購入を予定している。さらに、siRNA解析に必要となる合成核酸オリゴヌクレオチドと、アクリルアミドゲルなどを購入し、関節炎病態モデルマウスの解析に必要となる試薬類を購入予定である。以上の消耗品試薬類は比較的高額なものが多いために、繰り越しとなった金額と次年度計上額との合計金額分の消耗品試薬類の支出が見込まれる。さらに論文投稿を予定しており、別刷り代をはじめとした投稿に際する費用の支出が見込まれる。また、学会参加を予定しており、計上額の支出が見込まれる。
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