2017 Fiscal Year Research-status Report

炎症誘導性の細胞死に着目した、慢性炎症性疾患の病態の解明と治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	17K19877
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	浅野真未北海道大学, 保健科学研究院, 助教 (00779390)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小澤岳昌東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806) 尾崎倫孝北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80256510)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2020-03-31
Keywords	細胞死 / 炎症 / パイロトーシス / カスパーゼ / ガスダーミンＤ / 光プローブ
Outline of Annual Research Achievements	近年、アポトーシス以外の細胞死の存在に注目が集まっており、これらが周囲の細胞に様々なシグナルを発信して、炎症、免疫応答、線維化、修復、再生といった細胞死後の生体応答をコントロールしている可能性が明らかになってきている。パイロトーシスはカスパーゼ１依存性であり、ネクローシス様に細胞が破裂する細胞死である。細胞死直後にインターロイキン１βやインターロイキン18といった炎症性サイトカインを放出するため、炎症誘導性の細胞死といわれている。本研究は、周囲組織に炎症を惹起する壊死性細胞死として、主にパイロトーシスに着目し、これが炎症の持続と促進に関与していると考え、研究をおこなっている。まずはパイロトーシスの生体内での動的解析を目的として、光プローブの作成をおこなった。パイロトーシスはプロテアーゼであるカスパーゼ１により切断され、活性化したガスダーミンDが、細胞膜を破壊することにより細胞死を実行する。そこで、カスパーゼ１の活性化を検出するために、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ１の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブを作製した。この光プローブのカスパーゼ１特異的基質部位が切断されるとルシフェラーゼが活性化フォームにもどり活性化する仕組みを利用して、生体内でのカスパーゼ１の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系の確立を現在目指している。さらに、カスパーゼ１の活性化により誘引される生体内での分子生物学的変化をウェスタンブロット法やPCR法などを用いて解析した。具体的には、肝細胞株を用いて、CRSPR法によるカスパーゼ１の活性化をおこなっているところである。また、ガスダーミンDの活性化を誘引する因子について探索中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason カスパーゼ１活性化の検出を目的に、不活性化した環状のルシフェラーゼの間にカスパーゼ１の特異的基質配列を挟み込んだ光プローブのデザインと作製は完了した。現在、マウス肝細胞、マクロファージ（肝Kupffer細胞を想定して）への導入を試みている（リポフェクション、エレクトロポレーション法など）。十分なS/N比が得られていないため、プローブのデザインなどの改善を試みている。同時に、ガスダーミンＤをマーカーとしたパイロトーシスの評価法の検討を進めている。
Strategy for Future Research Activity	肝細胞株に光プローブを導入し、生体内でのカスパーゼ１の活性化を動的かつ経時的に解析できる検出系を確立する。その後、NASHなどの肝炎症性疾患において予想される肝細胞病態の解析を、光プローブを用いておこなう。マウスの肝臓実質細胞に光プローブを導入し、これをパルミチン酸やリポポリサッカライドなどで刺激することにより、脂肪蓄積、炎症を誘導し、パイロトーシスの発生の有無を同一細胞で動的かつ経時的に観察する。これにより、パイロトーシスが関与している可能性がある病態を推定する。また、パイロトーシスと他の制御された細胞死（ネクロプトーシス、アポトーシスなど）との比較検討を行い、これらの細胞死の各種病態における役割を解析する。つぎに、得られた結果をもとに、その関与がもっとも考えられる病態をもつマウス疾患モデル（NASHモデル、各種肝炎モデルなど）を作製する。
Causes of Carryover	次年度は光プローブの設計変更や細胞導入の方法の再検討を行うことで、光プローブの完成を目指す。また、現在解析途中である肝細胞株を用いたカスパーゼ１およびガスダーミンDの活性化の誘引因子の同定、活性化により誘引される生体内での分子生物学的変化の解析をウエスタンブロット法やPCR法などを用いて行う。