2018 Fiscal Year Research-status Report
周期的伸展刺激装置を用いた慢性腎疾患の新しいin vitroモデルの研究
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17K19925
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| Research Institution | Okayama Prefectural University |
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Principal Investigator |
入江 康至 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (70303948)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | 糸球体内皮 / 伸展培養 / エクソソーム解析 / 次世代シークエンサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
岡山県立大学において、ウシ糸球体内皮細胞由来の培養細胞株GEN-Tをシリコン製チャンバーに播種し、培養細胞伸展システム http://www.strex.co.jp/products.html を用いて機械的伸展刺激を加える系を構築した。
本システムは申請者の所属していた岩手医科大学の研究室で既に稼働中のものであり、チャンバーのコーティングや機械の温度管理などについて最適化がなされている。今回、岡山県立大学で購入した培養細胞伸展システムは、同じメーカーではあるが改良、更新されたモデルであり、特にシリコンチャンバーの処理システムが異なるため、伸展培養の要件を再設定した。その後、伸展刺激により発現誘導された12の遺伝子群についてタイムコース解析、各種メカノセンサーの阻害薬による解析を行い、データの再現性について検討を行った。
一方、糸球体高血圧モデルである伸展刺激を受けたGEN-T細胞が何らかの液性因子を放出して、遠隔臓器の内皮機能を傷害する可能性の検討については、最近の研究の動向から、GEN-T細胞由来のエクソソームが関与する可能性が浮上してきたため、エクソソーム解析を行う予定で準備を進めた。これは、伸展刺激を受けたGEN-T細胞と刺激を受けていない同細胞の上清からエクソソーム画分を精製し、ここに含まれるRNAを網羅的に比較解析するものである。
エクソソーム解析は次世代シークエンサーを使用して行う予定であるため、現在、別プロジェクトのサンプルを用いて次世代シークエンサーの手法についてデータ解析法も含めて習熟を図っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
培養していたGEN-T細胞の生育が不良となったため、販売元のDSファーマバイオメディカル株式会社から再度購入することとした。しかしながら、同社では在庫および今後の販売予定とも無いとのことで、同細胞株を樹立した東京女子医科大学新田孝作教授に分譲を依頼した。現在、分譲待機中である。このような理由から計画は遅滞しているが、研究手法自体に問題を抱えている訳ではないので、細胞分譲がなされれば研究を進めることができると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
万が一、GEN-T細胞の入手が困難な場合、糸球体内皮細胞の初代培養細胞を購入し、これに伸展刺激を加えることにより得られた培養上清を用いてエクソソーム解析を行う予定である。また、研究計画に示したCKDモデル動物を作成し、血液中のエクソソーム画分についても対象動物のものと比較解析する。
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| Causes of Carryover |
培養していたGEN-T細胞の生育が不良となったため、販売元のDSファーマバイオメディカル株式会社から再度購入することとした。しかしながら、同社では在庫および今後の販売予定とも無いとのことで、同細胞株を樹立した東京女子医科大学新田孝作教授に分譲を依頼した。現在、分譲待機中である。
分譲が行われれば、予定通りの研究を進めるが、万が一、GEN-T細胞の入手が困難な場合、代替手段として糸球体内皮細胞の初代培養細胞を購入し、これに伸展刺激を加えることにより得られた培養上清を用いてエクソソーム解析を行う予定である。また、研究計画に示したCKDモデル動物を作成し、血液中のエクソソーム画分についても対象動物のものと比較解析する。
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