核酸系旨味物質によるＡＭＰＫ活性化を介した抗炎症作用機構の探索

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K19941
• Research Institution: Beppu University
• Principal Investigator: 木村 靖浩 別府大学, 食物栄養科学部, 教授 (90549792)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 核酸系旨味物質 / 炎症性腸疾患 / AMPK / 坑炎症作用

Outline of Annual Research Achievements

研究者は、これまでに魚介類や食肉類に多く含まれる核酸系旨味物質のアデノシン一リン酸（AMP）及びイノシン一リン酸（IMP）を薬剤により惹起した慢性大腸炎マウスに投与したときに、大腸組織のAMP-activated protein kinase（AMPK）の活性化を介して、大腸組織における炎症性サイトカイン（TNF-α、INF-γ、IL-17A）産生が抑制され、下痢・血便の程度が改善して大腸の炎症症状が緩和されることを見いだしている。
そこで、本研究はAMP及びIMPによる大腸炎緩和作用のメカニズムを探索するため、炎症を起こした大腸の粘膜固有層に浸潤した炎症性ヘルパーT細胞（Th1・Th17）及び制御性T細胞（Treg）の免疫応答に焦点をあて、マウスにAMPを与えて同時にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）により慢性大腸炎を起こしたのち、大腸を摘出した。採取した大腸組織を酵素処理して密度勾配法により大腸粘膜固有層に浸潤した炎症関連免疫細胞を採取し、蛍光標識抗体により蛍光染色してフローサイトメトリー法によりTh1、Th17及びTregそれぞれの細胞割合を計測する方法の確立を行っている。しかしながら、マウス1匹あたりから大腸粘膜固有層の単核球は～100万個程度と少量しか採取できないため、各実験群の大腸（5～6匹分）をそれぞれプールして粘膜固有層から単核球を採取してフローサイトメトリーを実施した。その結果では、各T細胞画分においてAMP投与による明らかな差異は認められなかったが、CD4陰性・INF -γ陽性の細胞画分でAMP投与による増加が認められた。
今後は、大腸粘膜固有層からのヘルパーT 細胞の収量を増やすため、磁気ビーズ抗体を使ってヘルパーT細胞をさらに精製して分離及び解析する方法を検討したい。さらにCD4陰性・INF -γ陽性の細胞画分の細胞を特定したいと考えている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

予想以上にマウス大腸粘膜固有層からのT細胞採取の方法を確立するのに時間を要したため、本来計画していた実験を計画通りに実施するには至らなかった。実験を何回か繰り返し行ったが、Th1、Th17及びTreg細胞の分布に再現性が得られるようになってきている。

Strategy for Future Research Activity

計画通りに実施できなかった実験を遂行する。まずは、大腸粘膜固有層からのT細胞を採取する方法（磁気抗体ビースの使用など）の精度をあげて、T細胞の収量を増加する工夫を行い、後述の実験を早期に着手したい。すなわち、AMPを投与した慢性大腸炎マウスの大腸組織から炎症関連免疫細胞（Th1、Th17、Treg及びその他）を分取して、それらのAMPK発現とそれぞれの免疫細胞が特異的に産生するサイトカイン（INF-γ、IL-17A及びIL-10など）量との関連を調べ、AMP投与による抗炎症作用のメカニズムを検討する。

Causes of Carryover

平成30年度に計画していた実験が予想に反して計画通りに実施できなかったため、次年度使用額が生じた。

（使用計画）
次年度使用額は、実験動物、その飼料及び床敷、分析試薬・キット類等の購入に充当する。