2018 Fiscal Year Research-status Report
Interference of retinoic acid signaling on endocrine disruption
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17K20049
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
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2017-06-30 – 2020-03-31
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| Keywords | iPS / レチノイン酸シグナル / 化学物質 / in situ hybridizaion |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞においても分化時に化学物質が存在するとレチノイン酸(RA)シグナルが影響を受け、RA応答遺伝子の発現が変化することを確認した。この現象を詳細に調べるため、化学物質およびレチノイン酸の濃度を変化させてRA応答遺伝子の発現変化をリアルタイムPCRにより調べた。その結果、化学物質の影響はレチノイン酸濃度によって変化し、特に低濃度の時の影響が顕著であることがわかった。また、このメカニズムを明らかにするため、レチノイン酸受容体(RAR)サブタイプ特異的なアンタゴニストおよびアゴニストの存在下でRA応答遺伝子の発現変化を調べ、サブタイプ特異性を解析した。さらに化学物質の存在下、非存在下においてトランスクリプトーム解析を行い化学物質が遺伝子発現に与える影響を網羅的に解析した。特に化学物質がiPS細胞分化に与える影響を機能面から明らかにするため、遺伝子発現特性をGene ontology(GO)により特徴付けるGene Set Enrichment 解析を行った。ヒートマップ解析の結果、機能的類似性を有するGOが集まる特徴的なクラスター形成が認められ、化学物質が特定の細胞機能に影響する可能性が示唆された。
RAシグナルは細胞分化、器官・形態形成などに関与することが知られている。そこで化学物質がRA応答遺伝子の発現領域に与える影響を調べるため、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situ hybridization法による遺伝子発現解析の検討を行った。まずは、実験条件設定のため、ゼブラフィッシュ胚発生時に種々の濃度のRAを添加して、添加濃度、添加時期、検出時期の影響を調べた。その結果、発現への影響がRA添加時期に影響される可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトiPS細胞においてもin vitroでの分化実験系が確立でき、リアルタイムPCRによる発現変動解析、マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析が順調に進行している。また、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situ hybridizationの実験システムも順調に機能していることから、計画した方向性で実験が遂行可能と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトiPS細胞で得られた化学物質の影響が個体レベルでも認められるかを、ゼブラフィッシュ胚を用いたin situ hybridization法により確認する。この時、発現量のみならず特に発現領域の変化に着目する。課題は実験条件の設定であり、化学物質の添加量、添加時期、検出時期、検出に使用する遺伝子（プローブ）の選定など多くの項目があるため、これらを組み合わせた多くの実験条件を試す必要がある。その上で、ヒトiPS細胞とゼブラフィッシュ胚を用いた実験結果を統合して、RAシグナルへの影響という視点から化学物質影響、内分泌かく乱作用を明らかにすることを試みる。
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| Causes of Carryover |
遺伝子発現変化の解析、whole mount in situ hybridizationが予想より順調に進行したため。
mRNAおよびタンパク質発現の違いを詳細に示すため、高解像度写真撮影に顕微鏡のリースを予定している。
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