2019 Fiscal Year Research-status Report
Interference of retinoic acid signaling on endocrine disruption
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17K20049
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
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2017-06-30 – 2021-03-31
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| Keywords | レチノイン酸シグナル / iPS細胞 / ゼブラフィッシュ 胚 / 化学物質 / 細胞分化 / 形態形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞分化実験においてレチノイン酸(RA)、および化学物質の添加により発現が変動した遺伝子が個体発生時においても同様に変動するかを明らかにするため、ゼブラフィッシュ胚を用いてホールマウントin situハイブリダイゼーション法による遺伝子発現解析を行った。解析に先立ち、ゼブラフィッシュ胚におけるRAの効果の解析に適した条件、すなわち添加濃度、添加時期、検出時期を決定するため、複数のプローブを用いてそれらの発現を確認する条件検討を詳細に行った。その結果、数種の遺伝子群において、RAおよび化学物質の存在下で発現量のみならず、発現領域が変化することを確認した。発現領域の変化は将来の形態形成に影響する可能性を示唆する興味深い現象であると考えられた。一方で、この条件検討において、遺伝子発現に影響を与えるRAの閾値濃度に関し、再現性に問題があることが明らかとなった。そこで、餌、ゼブラフィッシュ個体、RA・化学物質溶液の保存と調整方法、ゼブラフィッシュ胚の発生に使用する溶液、容器など詳細な条件において個々の検討を行った結果、化学物質の効果は様々な実験条件の影響を受けやすく、その影響を定量的に示すためには厳密な実験条件のコントロールが必要であることが明らかとなった。そこでRAおよび化学物質の保存や作成、添加方法などの実験条件を精緻化し、非常に厳密な実験条件のコントロールを行うことにより、再現性が高い実験条件を設定することが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situハイブリダイゼーション解析自体は順調に進行したが、RA、および化学物質の影響を定量的に解析しようとした場合、再現性に難点があることが明らかとなった。その原因究明、および安定した結果を得るための実験条件の設定が必要となり、当初予定していなかった時間を要した。
しかし、研究全体としてはゼブラフィッシュ胚においても、iPS細胞分化実験同様、発現量の変化に加え、発現領域が変化することを見出した。すなわち当初の計画通り、細胞分化実験により得られた現象が実際の個体発生においても起こることを確認することができた。また、化学物質の個体発生への影響解析実験においては、非常に厳密な実験条件のコントロールが必要であることが明らかとなり、本研究により再現性の高い実験条件を設定することができたことは、今後の研究の進展に有益である。
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| Strategy for Future Research Activity |
精緻化した実験条件下において、ゼブラフィッシュ胚を用いたホールマウントin situハイブリダイゼーション解析を行い、その発現領域の変化を中心としてRA、および化学物質が個体発生に与える影響を定量定量的に示す。この時、ヒトiPS分化実験で得られた発現変動遺伝子のゼブラフィッシュオーソログをプローブとして用い、それらの遺伝子機能の観点から化学物質が個体発生時のレチノイン酸シグナルに与える影響を明らかにする。またその結果として組織にどのような変化が生じたかを明らかにするため、孵化個体の切片を作成し、頭部を中心に組織学的解析を行い、RAおよび化学物質が頭部、脳形成に与える影響を明らかにする。最終的に細胞分化実験と個体発生実験の結果を統合してレチノイン酸シグナルの観点から化学物質の影響を解明する。
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| Causes of Carryover |
ゼブラフィッシュ胚を用いたin situ hybridization解析において、飼育条件、薬剤調整・添加条件によって結果が変動することが判明し、実験条件をさらに精緻化する必要が生じたため。
再現性の高い結果を安定して得るために、特に薬剤調整条件・添加条件とそのin situ hybridization解析への影響を調べ、至適条件において実験、解析を行う。次年度使用額は主にin situ hybridization等、遺伝子発現解析に使用予定である。
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[Journal Article] Transcriptome analysis revealed bisphenol A and nonylphenol affect reproduction2019
Author(s)
Tanaka T., Ono Y.,Hikihara N., Yoshida A.,Yamada H.,Higaki S., Nishie T., Tooyama I., Iida K., Hirasawa A., Takada T.
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Journal Title
Reprod. Toxicol.
Volume: 88
Pages: 39-47
DOI
Peer Reviewed
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