Discovering growth substrate of E. coli in the environment

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K20060
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 栗栖 太 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (30312979)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鎌田 素之 関東学院大学, 理工学部, 准教授 (10386873)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: 大腸菌 / 未知スクリーニング分析 / ノンターゲットスクリーニング / 高分解能質量分析計 / 精密質量分析

Outline of Annual Research Achievements

大腸菌の増殖前後における低分子有機物変化の差分分析として、前年度の検討で大腸菌の増殖が見られた多摩川河川水の試料を再度採水し、増殖試験を実施した。増殖前後の試料を固相抽出し、HPLC-四重極Orbitrapハイブリッド質量分析計で分析した。試験は3連で行い、増殖前後で有意差があるコンポーネントを31個抽出した。
抽出されたコンポーネントについて、精密質量から分子式推定を行った。分子式組成から、Kendrick Mass Defect（KMD）を計算したところ、同一のKMDを持つものが存在したことから、共通した骨格を持つ化合物群があることが推定された。さらに、MS/MS分析を行ったところ、11個に対してMS/MSデータを取得でき、うち3個についてはMS/MSフラグメントパターンと既存のデータベースとの比較により、物質の候補を挙げることができ、1つはチロシンメチルエステルであった。標準物質を入手し比較したところ、分析結果に違いがみられたことから、異性体である可能性が示唆された。
次に、河川水を0.2umでろ過し細菌を除去したものと、0.8umでろ過して河川水中の細菌類は残したものとで、大腸菌の増殖試験を行った。.8umでろ過した試水中では、0.2umでろ過したものに比べ、大腸菌の増殖は有意に小さかった。Orbitrap質量分析計で分析したところ、0.2um試料で大腸菌が利用したと思われる物質は、0.8umろ過試料でも減少していたことから、大腸菌と河川水中の細菌で基質の競合が起こっており、その結果として大腸菌の増殖が抑制されていたと考えられた。
また、実験室分離株のほかに、琵琶湖から分離された大腸菌株も用い、琵琶湖湖水での増殖試験を実施したところ、対照試験よりも優位に増殖する大腸菌株もあった。自然界においても大腸菌が環境水中の溶存有機物を利用して増殖していることが確かめられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していなかった、大腸菌と他細菌との増殖競合の試験についても実施する事ができた。一方で、大腸菌が利用する基質については、分子式の推定はできたものの、物質の完全な同定にまでは至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

成果の取りまとめとしては、4月28日～5月3日に実施されるTranscon2019にて、本研究成果の発表を行う。また、大腸菌と他細菌の基質競合の成果について、原著論文を執筆中である。研究面としては、大腸菌が利用する基質について、物質の構造推定を引き続き実施していく。利用される物質の濃度が低いため、同定をしやすくするためにできるだけ大容量で試験をする必要がある。

Causes of Carryover

国際学会"TransCon2019: Understanding and managing microbial biotransformation of environmental contaminants"（開催地：スイス、会期：2019年4月28日～5月3日）に参加し、成果発表を行うため。また、追加実験として大腸菌の増殖基質候補となっている物質の構造推定を実施するため。