2017 Fiscal Year Research-status Report

Reconstruction of a bone development model by a 3-D cell culture system

Research Project

Project/Area Number	17K20079
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	穴田貴久東北大学, 歯学研究科, 准教授 (30398466)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	鈴木治東北大学, 歯学研究科, 教授 (60374948)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2020-03-31
Keywords	細胞培養デバイス / 軟骨細胞
Outline of Annual Research Achievements	内軟骨性骨化は骨形成過程の一つであり、軟骨により雛形が形成され骨に置き換わる発生過程である。我々はこれまでに酸素濃度が三次元培養した場合に細胞の生存や分化に極めて大きな影響を与えるという知見を得ている。細胞分化において細胞周囲のマイクロスケール環境や成長因子などの濃度勾配が重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、気体分子である酸素濃度を制御し、酸素濃度勾配を細胞に与えることは難しく、酸素濃度勾配の軟骨分化に与える影響について検討した研究はほとんどない。そこで本研究では二つの新規三次元細胞培養法を提案し、これまでにない間葉系幹細胞から軟骨細胞分化と血管侵入という内軟骨性骨化を生体外で再現、再構築することを目指し、骨発生機序のモデル培養系を確立することを目的とする。まず、三次元培養した幹細胞組織体の周囲に酸素濃度勾配を生じさせることができる培養デバイスを設計、作製し、生体を模倣した長軸方向に軟骨細胞の分化勾配のある三次元組織体を作製する。酸素濃度勾配は、培養デバイス中の培地に大気から供給される酸素量と細胞組織体により消費される酸素量のバランスにより生じる。作製した三次元組織体の軟骨分化について評価を行う。 29年度は、市販の中空糸モジュールにマウス軟骨細胞株ATDC5または間葉系幹細胞を充填し、軟骨細胞分化誘導培地を使って培養を行った。培養には酸素濃度勾配を形成するための培養デバイスを作製した。中空糸モジュール内に播種する細胞数を変化させて培養を行った。培地はインシュリンやTGF-b3などの成長因子を含む軟骨細胞分化誘導培地を用い、3から4週間培養し、軟骨細胞分化を誘導した。軟骨細胞分化マーカーについて評価を行った。三次元培養環境下で軟骨細胞が培養でき、分化が誘導されることが確かめられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 中空糸モジュールを設置し、酸素濃度勾配を作るための培養デバイスの作製に予定よりも時間を要しているため。
Strategy for Future Research Activity	培養デバイスを作製し、酸素濃度勾配が形成される条件を詳細に検討する。細胞を回収し、組織切片を作製し、種々の染色法により軟骨分化の確認を行う。また、PCRにより分化マーカーの発現量を定量する。ハイドロゲルを用いて血管内皮細胞との共培養を行っていく。代表者の所属が変わったため実験の再セットアップが必要となったが遅れを取り戻すよう研究を進めていく予定である。
Causes of Carryover	細胞培養条件の検討と細胞培養デバイスの最適化が予定よりも遅れたため次年度により詳細な検討を行うため。