2017 Fiscal Year Research-status Report

The creation of the de novo vector for the newly Cell Delivery System (CDS)

Research Project

Project/Area Number	17K20103
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	光永佳奈枝京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点助教 (10398240)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2021-03-31
Keywords	フリーアミン / フローサイトメトリー / ミクソゾア / イメージストリーム / さしみ
Outline of Annual Research Achievements	この研究では、筋ジストロフィー症などの全身性難病の治癒を目標とし、再生医療において夢の技術とされる治療細胞を全身へ運ぶ運び屋（ベクター）を作成する。現在の移植技術では局所的な移植をする他はなく、全身性の疾患の場合、全身の治癒を目的とした細胞移植は困難となる。筋肉への遊走性が高く、筋組織に寄与し、構造的に細胞を包接しうるミクソゾア類に着目し、移植細胞と共に全身の筋肉組織に運ぶ運搬体に仕上げていく。市販のさしみ類を用い、フリーアミンに結合する細胞体をFACSで単離し、フロー内でイメージングを行なった。ミクソゾア類が寄生している魚の筋組織はFACSで見分けられる二つの集団がコンパクトに分けられ、どちらもミクソゾア類が含まれていることから、ヘキストで染色したのちに解析を行なった。ベクター候補としたミクソゾアの虫は8つの細胞で構成される細胞体で、真ん中に空洞を持つ。イメージストリームでは立体構造を持つこの細胞体を詳しく観察することができなかったため、スライドガラスに直接Sortingを行ない、イメージング用スライドサンプルを得た。宿主材料としたのは、HM：ヒラメ、マグロ（flounder, tuna: HM,）BTK：鰤、鯛、鰹（Yellowtail, sea bream and bonito: BTK）の5種類である。これらはそれぞれ処理時に混ぜ合わせ、２つのサンプルとした。この解析は現在進行中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 計画内では市販の刺身からミクソゾア類を大量に採取し、解析に必要な数を単離する予定であった。しかしながら材料となる刺身をランダムに選んでいたため、採取した候補寄生虫ミクソゾア類の数を採取できなかった。また、魚の筋組織が多い場合、6時間かけた1回のSortingで2000個程度しか採取できず、時間と回数を繰り返してもイメージングをする程度程しかSortingできない。Sorting後のサンプルを解析せず、凍結保存を行なった際には2000個程度では融解した後の状態が悪く、解析には十分ではなかった。培養方法を用い、ミクソゾアを保持する方法にまでは至っていないため、当初予定から大きく後れをとっている。またこの研究の開発に着手した2015年の次の年の資金調達ができなかったことから、以前の実験から1年ほどのブランクがあり、実験再開に時間がかかったことと、スーパーで購入するさしみの経理処理方法がわからず、12月ごろからの研究再開となったため、計画から大幅に遅れることとなった。
Strategy for Future Research Activity	魚に寄生するミクソゾア類が多くなるのは時期特異的なものがあるらしく、また1000種類以上存在することから、ミクソゾアの大量採取を後回しにし、市販の刺身からとれる1000個程度の細胞体で遊走実験ができる実験系を立ち上げる。そのため骨格筋、そのほかの細胞種を培養し、まず、そこに単離したミクソゾア類をふりかけ、ベクター候補としたミクソゾアが筋組織に浸潤することを確認し、その後遊走を解析するためのシャーレの開発を行なう。候補としたミクソゾアが筋組織に遊走しない場合は、他種類のミクソゾア類を単離し、筋組織に確実に寄与し遊走する種類を選別する。少ない細胞でイメージングができるシャーレの開発が必要であるため、各メーカーが出す情報を頼りに、最適な遊走実験観察シャーレを開発する予定である。また宿主となる魚の材料については、ミクソゾアが寄生しやすい砂地に生活する魚を増やし、開発当初に使ったヒラメ、天然のマグロ、鯛、鰤、鰹の他、食中毒が増えるとされる時期の魚も用いる。6月期になると材料となるこれらの魚の販売が促進されることから、夏までにはターゲット宿主となる材料を確定したい。ミクソゾアの遺伝子解析のために、少ない細胞体でもゲノム精製、及びRNA採取を行なう。マウスの細胞においては、100個から500個の細胞でRNA採取やゲノム精製を行なえることから、同様にミクソゾアでも遺伝子の生成が可能であることを検討する。 FACSにおけるミクソゾアの単離にはどうしても筋組織のコンタミネーションの問題がついて回る。より細胞体の精製度をあげるために磁器ビーズを使った、濃縮をかけられる手法についても検討する。