2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of sequential and reaction process with monolithic column module for small antibodies PEGylation
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17KK0116
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
吉本 則子 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (40432736)
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| Project Period (FY) |
2018 – 2020
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| Keywords | モノリス / イオン交換クロマトグラフィー / グラフト型ポリマーリガンド / 吸着反応 / 結合様式 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は、ポリマーグラフト型担体を導入したモノリスディスクの作成を行い、モデルタンパク質としてBSAを用いて、それらのクロマトグラフィー溶出挙動の解析を行ったが、今年度はポリマーグラフト型イオン交換リガンドとタンパク質の相互作用を非破壊的に解析する手法として等温滴定熱量計（ITC)の応用を試みた。現有のITCセルではモノリス担体を導入することができないため、多孔性の微粒子型充填剤でグラフト型ポリマーリガンドが導入されたものを代替して用いた。モデルタンパク質にはBSAに加えてヒト化モノクロナール抗体を用いpHや塩濃度といった環境条件が相互作用に与える影響について調べた。ITCでの滴定実験の条件設定のために、96wellプレートを用いて、各条件下でのプレート内で吸着実験を行い吸着等温線を作成した。ITCで得られた熱量を吸着等温線から得られた吸着量をもとに規格化し、1分子当たりの吸着反応のエンタルピーを決定し、吸着反応の平衡定数は吸着等温線の線形領域から求め、反応の自由エネルギーを算出した。さらに、自由エネルギーとエンタルピーを用いて、エントロピーを求めた。これまでの一般的なカチオン交換担体と比較した場合、グラフト型ポリマーリガンドは細孔空間を吸着に使えていることから高い吸着量が得られたが構造によって、その吸着反応は発熱ではなく吸熱的に進行しておりエントロピー支配で反応が進行するものがあることが示された。また等電点近傍でタンパク質の表面電荷が減少した場合においても、グラフト型ポリマーリガンドは吸着を維持していたが、その反応ではエントロピーの寄与が大きいことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
モノリスクロマト担体の吸着反応の熱力学的な解析を行うためには、共同研究者の保有する装置を使用して実施する必要がある。しかし、共同研究者のいるスロベニアに入国することが難しく実施ができていない状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回用いたBSA、ヒト化抗体に加えて断片化抗体を作成し、多孔性の微粒子型担体にグラフトポリマーリガンドを導入したものとの相互作用を解析し、日本国内において実施可能な吸着様式の解析に関する研究について実施を行う予定である。一方で、モノリス担体の解析については共同研究者の保有する装置での実施を検討する。
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