遺伝性神経疾患における軸索輸送キネシンKIF1Aの制御メカニズムの破綻

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17KK0139
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 丹羽 伸介 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (30714985)
• Project Period (FY): 2017 – 2019
• Keywords: 軸索輸送 / KIF1A / UNC-104

Outline of Annual Research Achievements

シナプス小胞の軸索輸送に関与する分子モータータンパク質KIF1Aは自己阻害と呼ばれるメカニズムによって制御されている。例えるならば、KIF1Aは自動車であり、自己阻害はそのブレーキに当たる。KIF1Aの変異が自己阻害によるブレーキに異常を起こし、神経疾患を引き起こすメカニズムを解析するために、まずCOS-7細胞に変異型KIF1Aを発現して細胞を破砕し、その上清を用いて1分子アッセイを行った。その結果、3つの変異型KIF1Aで微小管への結合割合が増えていることがわかった。これは神経疾患を引き起こすKIF1Aの変異が自己阻害によるブレーキの破綻を引き起こしていることを示唆する。
線虫は神経細胞生物学の優れたモデルである。上記の実験で同定したヒトKIF1Aで自己阻害に関与しているアミノ酸はすべて線虫のKIF1AホモログであるUNC-104においても保存されている。そこでCRISPR/cas9法を用いたゲノム編集を用いた変異の導入により疾患も出る線虫の作成を行った。その結果、3つの変異のうち、2つは導入に成功した。この二つの変異体を疾患モデル線虫として解析することにした。シナプス小胞マーカーであるGFP::RAB-3をmig-13プロモーターによって発現してタイプラプス解析を行ったところ、シナプス小胞の軸索輸送が増えていることがわかった。また、疾患モデル線虫ではシナプス小胞が本来存在しない軸索末端や樹状突起といった部位に異所局在することがわかった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

1分子アッセイの系が予想以上うまくいき、KIF1A変異のうち3つの家系から分離した変異で自己阻害によるブレーキが失われていることがわかった。CRISPR/cas9を用いた疾患モデル線虫は2家系分作製することに成功した。これを用いた解析により疾患モデル線虫では軸索輸送が亢進していることを明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

培養細胞の上清を用いた1分子解析で神経疾患において軸索輸送モーターの機能が亢進していることは十分に示せているが、
「よりきれいな系」においてこれを示したい。そのためにバキュロウイルスを用いてヒトKIF1A全長を発現・精製し、1分子アッセイを実施する。