2018 Fiscal Year Research-status Report

ゼブラフィッシュ胚性ゲノム活性化におけるクロマチン核内配置と転写制御機構

Research Project

Project/Area Number	17KK0143
Research Institution	Tokyo Institute of Technology
Principal Investigator	佐藤優子東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (70435882)
Project Period (FY)	2018 – 2020
Keywords	エピジェネティクス / ライブイメージング / 胚性ゲノム活性化 / ゼブラフィッシュ / ヒストン修飾
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、ゼブラフィッシュ初期胚発生過程におこる胚ゲノム活性化（Zygotic genome activation; ZGA）における、クロマチンレベルでの転写活性化制御機構を明らかにすることを目的としている。我々はこれまで、ZGA初期の活性化型RNAポリメラーゼII（RNAP2 Ser2phおよびSer5ph）動態をライブイメージングにより観察し、細胞核内でfociに集積することを見出している。平成３０年度は、RNAP2 Ser2ph fociと共局在が見られる遺伝子を調べるため、ゼブラフィッシュ胚に対するRNA FISHを行った。ゼブラフィッシュ初期発生過程では細胞分裂が同調している。転写が起こっている間期のタイミングで胚を固定するため、蛍光標識したRNAP2 Ser5ph抗体由来抗原結合断片（Fab）を１細胞期胚へマイクロインジェクションにより導入し、共焦点蛍光顕微鏡下でライブイメージングを行い、RNAP2 Ser5ph fociが出現するタイミングで胚を固定した。まずZGA初期に高発現することがすでに知られているマイクロRNA（miR-430）に対して、４種類のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、蛍光標識したものを用いてRNA FISHを行ったところ、64細胞期からシグナルが見られた。また、miR-430を標的とするモルフォリノオリゴヌクレオチドを既報（Hadzhiev et al., Nat. Comm., 2019）を参考にして作成し、Cy3標識したものをAlexa Fluor 488標識RNAP2 Ser2ph Fabと共に１細胞期胚へ導入してライブイメージングを行ったところ、miR-430のシグナルはRNAP2 Ser2ph Fabと共局在することがわかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の予定では、ゼブラフィッシュ初期胚に対するRNA FISHサンプルの観察は、渡航先であるニューヨーク大学Timothee Lionnet博士の研究室で構築されたDiSPIM顕微鏡を用いて行う予定であった。しかし今回の渡航期間内ではDiSPIM顕微鏡が完成しておらず、他の顕微鏡を使用しなければならなかったため、条件検討等に時間を要した。
Strategy for Future Research Activity	ゼブラフィッシュ初期胚の間期の細胞に対して、ZGA初期に発現する遺伝子をHybridization chain reaction（HCR、RNA FISHよりも高感度に転写産物を検出できる）により検出し、転写サイトの核内配置を明らかにする。今回検出したmiR-430の転写サイトとの相互関係を明らかにする。また、活性化型RNAポリメラーゼII（RNAP2 Ser2phおよびSer5ph）の免疫染色との共染色を行い、核内配置を明らかにする。

Research Products
(1 results)

All Journal Article (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results, Open Access: 1 results)

[Journal Article] Quantitative measurements of chromatin modification dynamics during zygotic genome activation2019
- Author(s)
  Yuko Sato, Lennart Hilbert, Haruka Oda, Yinan Wan, John M. Heddleston, Teng-Leong Chew, Vasily Zaburdaev, Philipp Keller, Timothee Lionnet, Nadine Vastenhouw, Hiroshi Kimura
- Journal Title
  
  bioRxiv
  
  Volume: 601393 Pages: -
- DOI
  https://doi.org/10.1101/601393
- Open Access / Int'l Joint Research