2017 Fiscal Year Research-status Report

Study of substrates transport mechanism of organic acid exporter for efficient organic acid production via fermentation process

Research Project

Project/Area Number	17KK0148
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	七谷圭東北大学, 農学研究科, 助教 (00547333)
Project Period (FY)	2017 – 2019
Keywords	トランスポーター / 構造解析
Outline of Annual Research Achievements	有機酸発酵生産の効率化に向けた有機酸排出トランスポーターの基質輸送機構の解明に向けて、平成29年度は下記の研究を実施した。実施期間（平成30年2月～3月） (I) 熱力学的手法によるAAExトランスポーターの機能メカニズムの解析渡航先において、トランスポーターの基質輸送機構の解明を目的に、トランスポーターが基質と結合した際に発生する熱量を等温滴定型熱量測定装置を用いて計測する予定である。そこで平成29年度は、渡航前の準備として、等温滴定型熱量測定に必要な高濃度タンパク質溶液の調製方法の検討を行った。標的とするトランスポーターは、高濃度に濃縮することで凝集する性質があったことから、安定的に濃度を上げるために必要なbuffer条件や精製方法を検討し、タンパク質の濃度を8.9mg/mlまで上げる事に成功した。 (II) 立体構造認識抗体を用いた AAEx トランスポーターの構造安定化と構造解析トランスポーターの構造の安定化に向けて、抗体作製のためのタンパク質の精製と抗体の作製を共同研究者と共同により実施した。タンパク質の精製においては、立体構造を保持した条件で精製を行うため、pHやイオン等の条件を最適化した条件で実施した。精製タンパク質については、ゲルろ過クロマトグラフィーにより凝集や複合体の解離などが無いことを確認した。精製タンパク質をマウスに投与し、結晶化の候補となる抗体を複数種類選抜した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成30年度の渡航先における(I) 熱力学的手法によるAAExトランスポーターの機能メカニズムの解析、(II) 立体構造認識抗体を用いた AAEx トランスポーターの構造安定化と構造解析の実施に向けて、必要な予備的な実験を進めた。高濃度タンパク質の取得は、(I),(II)ともに不可欠な検討項目であり、高濃度タンパクの取得により(I), (II)の実験が進められる状態になったことから、おおむね順調に進展していると判断した。また、構造認識抗体の取得に関しても、候補となる抗体が複数得られていることから、おおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度は、下記の(I),(II)項目について研究を実施する。 (I) 熱力学的手法によるAAExトランスポーターの機能メカニズムの解析平成29年度に確立した濃縮方法を用いて、高濃度タンパク質を調製し、渡航先において等温滴定型熱量測定装置を用いての基質結合による熱量の測定を実施する。 (II) 立体構造認識抗体を用いた AAEx トランスポーターの構造安定化と構造解析構造認識抗体の候補から、タンパク質との結合による熱安定性の向上や抗体の結合による輸送活性阻害の実験を実施し、抗体の選抜を行う。さらに渡航先にて、選抜した抗体を用いて、トランスポーターと抗体の複合結晶の作製を実施する。