2019 Fiscal Year Research-status Report
メタロシャペロンによる金属含有酵素の活性中心形成機構の解明
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17KK0154
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
増田 太郎 京都大学, 農学研究科, 助教 (40395653)
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2018 – 2020
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| Keywords | 金属含有タンパク質 / メタロシャペロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一般的に、全タンパク質の約1/3がその活性に金属補因子を必要とすると考えられており、タンパク質への金属補因子の適切な導入はタンパク質の構造形成と機能発現に極めて重要な意味を持つ。本研究では、鉄貯蔵タンパク質フェリチンへの鉄の集積機構と、銅含有酵素タンパク質であるフェノールオキシダーゼ及びヘモシアニンの構造形成過程の解明を目的とする。
ヒトにおける鉄貯蔵タンパク質フェリチンの鉄集積について、PCBP1（Poly-c-binding protein 1)が主要な役割を果たすことが、共同研究・渡航先のPhilpott博士のグループにより明らかにされてきた。報告者はPhilpott博士の研究室においてフェリチン-PCBP1間の相互作用について検討を行った。出芽酵母、ヒト培養細胞を用いて両タンパク質の共発現を行い、共免疫沈降法により両社の相互作用を解析した結果、PCBP1はヒトのフェリチンのうち高い鉄貯蔵活性を有するH鎖により高い親和性を有することが明らかになった。また、PCBP1は３つの相同なKHドメイン（KH-1, KH-2, KH-3）から成るが、そのうちKH3ドメインがフェリチンとの相互作用に重要な寄与をしていることが示された。
帰国後、両者の相互作用について定量的な情報を得るため、PCBP1配列中に存在する内性のトリプトファン残基の蛍光を利用したin vitroでのアッセイ系を確立した。このアッセイ系を用いて、各条件における解離定数を算出し、相互作用時のPCBP1のH鎖選択性とKH3ドメインの主たる寄与を確認した。これらの結果を踏まえ、フェリチンH鎖においてPCBP1との相互作用に主要な役割を持つアミノ酸残基の変異体を作製し、個々の変異体とPCBP1との相互作用を定量的に解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト由来フェリチンと鉄シャペロンPCBP1間の相互作用について、その選択性について定量的、定性的な知見が得られたため、概ね当初の研究計画通り進展していると考える。特に、in vitroの蛍光測定による両者の相互作用についての定量的な解析系を確立したことから、今後は解離定数の変化などを指標に相互作用に関与するアミノ酸残基の同定など更に詳細な解析を行うことが可能となった。フェリチンは多量の鉄を集積することにより、ヒトにおいても鉄代謝の中心的な役割を果たすが、その鉄貯蔵機構は明らかにはなっていない。本研究で確立したin vitroの蛍光アッセイ系を用いることで、PCBP1とフェリチンの相互作用が可能とするフェリチンの鉄集積機構の一端を解明できると考えられる。
また、基課題のフェノールオキシダーゼ、ヘモシアニンに関しても、フェノールオキシダーゼに続き、食用甲殻類由来ヘモシアニンの高分解能X線結晶構造解析に成功し、金属を含む活性中心の構造と活性の相関について詳細な検討を加えることが可能となった。
以上の理由から、本研究は概ね順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
フェリチン-PCBP１相互作用解析について、令和二年度前期に再びNIH・Philpott博士のもとで共同研究を行う予定であったが、今般の渡航自粛により実行困難となった。2020年度後期の状況を見て後期の渡航可否を判断する。
こうした状況から、日本でPhilpott博士と密に連絡を取りながら、主としてin vitroアッセイ系を用いて両タンパク質の相互作用とフェリチンの鉄集積機構に関する詳細なメカニズムの解明を目指す。
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