2019 Fiscal Year Annual Research Report
Metagenomic virus detection in clinical specimens using high-throughput sequencers
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17KK0170
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
黒崎 陽平 長崎大学, 感染症共同研究拠点, 准教授 (40415443)
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| Project Period (FY) |
2018 – 2019
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| Keywords | ウイルス / 出血熱 / 次世代シークエンス / ナノポアシークエンス / メタゲノム / 診断 / 分子疫学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、英国公衆衛生局と共同でクリミア-コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)のナノポアシークエンサーMinIONによるウイルスゲノム配列決定法を開発した。今回、迅速かつ効率的にCCHFVゲノム配列を決定するため、RNA試料からMultiplex tiling PCRにてウイルス全長配列を増幅し、MinIONによるアンプリコンシークエンスを行う手法を採用した。昨年度、一部のゲノム領域で十分な深度が得られない現象がみられたが、tiling PCRの反応条件を改良することで、抽出RNAからウイルス全長配列をカバーする出力リードを得た。また、バイオインフォマティクス手法によりMinIONの出力リードからCCHFVのゲノム配列を決定するパイプラインを新たに構築した。異なるlineageに属する複数の配列既知のCCHFV株についてシークエンスを行い、GenBank上に登録される塩基配列と比較したところ、93-100%のシークエンス精度を得ることを確認した。タジキスタンにて採取されたCCHFV陽性マダニ試料について、本法にてウイルス全長配列(6株)を決定した。新たに決定した配列を用いて分子系統解析を行い、いずれの株も中東及び中国分離株が属するAsia-1 lineageに属することが分かった。
また本研究では、ナノポアシークエンスによるメタゲノム解析を目的としたSISPA(Sequence-independent single primer amplification)法の最適化を行った。またsemi-nested RT-PCRによる網羅的ナイロウイルス検出法を新たに開発した。これらの手法はCCHFVに限らず、CCHFVが属するナイロウイルス、更にダニ媒介性ウイルスの分子疫学研究ツールとして有用であり、将来的なCCHFVを含むナイロウイルスの分子疫学研究への道筋をつけた。
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[Journal Article] Development of an RT-LAMP assay for the detection of Lassa viruses in southeast and south-central Nigeria.2019
Author(s)
Pemba CM, Kurosaki Y, Yoshikawa R, Oloniniyi OK, Urata S, Sueyoshi M, Zadeh VR, Nwafor I, Iroezindu MO, Ajayi NA, Chukwubike CM, Chika-Igwenyi NM, Ndu AC, Nwidi DU, Maehira Y, Unigwe US, Ojide CK, Onwe EO, Yasuda J.
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Journal Title
Journal of Virological Methods
Volume: 269
Pages: 30-37
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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