2019 Fiscal Year Research-status Report
International promotion program for toxinological research on venomous animals
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17KK0179
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
塩井 成留実 (青木成留実) 福岡大学, 理学部, 助教 (50510187)
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| Project Period (FY) |
2018 – 2020
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| Keywords | anti-venom antibody / 出血毒金属プロテアーゼ / inhibitor / toxinology |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、国際共同研究より世界で多くの犠牲者を出す毒ヘビ咬傷被害を社会情勢および学術的な研究背景に潜む問題点を具体化すること、また、ヘビ毒研究の進展させることを目的としている。 本研究の具体的な研究計画は、（１）世界の毒生物被害の現状把握とその治療法についての情報を集め、具体的な解決策を検証する、（２）毒ヘビ咬傷治療薬開発におけるプラットフォームを構築する、（３）有毒生物研究の活性化となる毒素生産細胞株を樹立する、としている。
上記の目的と初年度の成果状況を考慮して、調整された2019年度(2年め)の実施計画は、(1)国際的に毒ヘビ研究専門家とコミュニティの立ち上げ、（２）抗毒素抗体の大腸菌発現系構築と調製、（３）ヘビ組織初代培養条件の確立の３つであった。その計画に沿った、実施成果の概要を下記3つに分けてまとめる。
（１）2019年度は、国際・国内学会に積極的に参加し、本研究成果を積極的に発表し、学会賞として評価された。また、初年度から世界の有毒生物研究分野の専門家が集うコミュニティに加わり、親睦や信頼関係が深まり、共同研究よりヘビゲノムのデーターベースを扱えるようになった。
（２）M13ファージディスプレイライブラリより、ヘビ咬傷の後遺症の原因毒素である毒ヘビ出血毒金属プロテアーゼに特異的に結合するVHH抗体を探索した。さらに、大腸菌を用いてその抗毒素抗体の発現系の構築を行い、比較的安価で量的に調製できる抗体作成を目指した。
（３）沖縄県衛生環境研究所の協力により、毒ヘビ組織（6種類）を採取し、初代培養の条件確立を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
理由は、研究実績の概要で述べた実施計画に沿って、渡航先研究所で2019年度の研究を立ち上げ、推進してきたが、後期2020年1月以降は、COVID-19の世界的混乱が大きく影響し、帰国することになり、実験計画が途中となっているものがある。その点も踏まえて現在の具体的な進捗状況は以下にしめす。
（１）の目的を達成するために、2019年度後半には、アジア近隣諸国（マレーシア、タイ、ベトナム、インドネシア、中国など）の研究者と親睦を深め、現地の人たちの被害状況や各国に生息する毒ヘビについての研究をサンプル採取のやり方など、情報提供をお互いに行うことを予定としていたが、各国への渡航計画が中止となった。2020年度前半はその渡航計画は、困難であると予測された。
（２）申請者が毒ヘビより見つけ出した血清タンパク質を基盤としたヘビ毒阻害剤の構築については、比較的長いペプチド合成(30－40残基)を試みたが、疎水性領域の合成の収量が悪く、デザインおよび合成条件の検討が再度必要である。並行して、大腸菌を用いてタンパク質Tag融合型阻害ペプチドの発現系も試みている。一方、M13ファージを使ったVHH抗体ライブラリを用いて、出血毒素に特異的に結合するファージを9種類単離することに成功した。それらのVHH抗体は、大腸菌発現系を用いて可溶性分画に比較的高収率で調整することに成功した。そのうち出血毒素と特異的かつ高い親和性(KD =1.39 nM)を示すVHH抗体の調整をおこなっている。引き続き、動物実験で阻害能と安全性を評価する。
（３）新鮮なヘビ組織(毒腺、ホホ筋肉、肝臓、精巣、卵巣、胆のう)を用いて初代培養を行った、結果的に、肝臓組織より血球細胞を得ることができ、凍結融解を繰り返しても比較的継続的に培養が可能となっている。また、卵巣組織より、線維芽細胞らしきものが単離できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度の実施計画は、COVID-19の影響による2019年度の計画の遅れと今後の世界情勢に臨機応変に対応できるよう、以下の3点を中心に計画している。
・毒素阻害剤評価について：動物実験の再開ができ次第、in vivo評価が円滑に実施できるように、十分量の組み換え体VHH抗体の調製を行っておく。また、毒ヘビ出血毒阻害の強さの程度によっては、高親和性を保ったまま、より強い阻害を示すことができるように、変異体を作成する。さらに特異的結合、または、阻害に必要な領域に関する残基の情報をNMR法、Ｘ線結晶構造を用いて構造的観点から得ることを試み、変異体デザインに役立てる。一方、毒ヘビ自身が持つ内在性毒素阻害タンパク質を基盤としたペプチドについては、ヘビ咬傷の後遺症の主要毒素の阻害に着目し、タンパク質発現系を立ち上げ、必要な残基を同定した後に、ペプチド合成を行いやすいペプチドの合成を行う。
・毒腺、腫瘍組織のサンプリングと培養：まずは、日本国内においてサンプルリングを行い、他国でのサンプリングについては、2021年以降を中心に行う(COVID-19 の状況が改善した後)。具体的には、組織採取方法やDNAおよびゲノム抽出の方法など、遺伝子分野の専門家たちとディスカッションし、プロトコールの統一を目指し、サンプルとデータの品質が向上できるようにする。これらは、Toxinology分野の専門家たちが集う国際会議やミーティングに参加して、様々な意見をもらいながら、改善を加え、公表することでその方法を世界に浸透させ行くことを目指す。また、2019年度のハブ血球細胞および繊維芽細胞については、増殖曲線の作成、および、不死化を目指してトランスフェクション方法の検討を引き続き行っていく。
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Research Products
(16 results)
