Wet-Dry融合アプローチを用いた産業応用酵素の遷移状態制御による新機能創製

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17KT0010
• Research Institution: Rikkyo University
• Principal Investigator: 常盤 広明 立教大学, 理学部, 教授 (10221433)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541) ; 石川 岳志 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (80505909)
• Project Period (FY): 2017-07-18 – 2020-03-31
• Keywords: 産業応用酵素 / 人工酵素 / 第一原理計算 / 分子動力学シミュレーション / 高解像度X線構造解析 / フラグメント分子軌道計算 / 基質特異性

Outline of Annual Research Achievements

高い選択能を有する酵素の特性を生かした産業応用酵素群の開発は、資源の乏しい我が国において世界を牽引する科学技術革新として極めて重要な課題である。そこで本研究では、高精度な第一原理計算を用いた『Dry (計算化学、バイオインフォマティクス) 』手法と熱化学測定やX線結晶構造解析などを用いた『wet (酵素化学、構造生物学)』実験とを融合した新たなアプローチにより、高い選択能を有する酵素の特性を生かした産業応用酵素群を合理的に設計・開発することを目的としている。実際の対象としては、血液サンプル中に含まれる特定のアミノ酸、L-Thr濃度の定量計測への応用が期待されている短鎖型L-スレオニン脱水素酵素(TDH)等の標的タンパク質を取り上げた。特に、酵素反応における遷移状態を明らかにするだけでなく、天然型酵素の機能を目的に合わせて改変し、反応そのものを分子レベルで制御することで、天然酵素の活性を凌駕し、適用範囲を拡大した人工タンパク質（人工酵素）の合理的設計開発を目指した。今年度は昨年に引き続き、各種標的酵素に対する理論的解析をさらに推進した。特に、フラグメント分子軌道（ＦＭＯ）計算に基づいて、標的酵素と基質との各種相互作用エネルギーを効率的に３Ｄ表示をする汎用化ツール群の開発に成功した。これらの結果は国内外の学会等で発表するとともに、専門誌（J.Chem.Info.Model）に公表した。このツール群の詳細な解説および酵素系への応用については、Springerより今年度発刊予定の書籍中に掲載予定である。さらに、これまでの構造を基盤とした解析に加えて、配列解析に基づくバイオインフォマティックスを利用した新たなWet-Dry融合解析により、基質特異性の起源の解明だけでなく、産業応用上、さらに機能向上した新規アミノ酸定量用酵素の合理的な創製への道を開くことができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度に引き続いて、実験担当の静岡県立大、ならびにプログラム開発担当の鹿児島大の両分担グループとの密なる連携の下、Wet-Dry融合が機能的に進行し、順調に共同研究が遂行された。特に昨年度、実験的に高精度な構造決定がなされたmTDHのapo-型構造に対して、ＦＭＯ計算に基づいて基質―酵素間の相互作用エネルギーを定量的に評価・解析するために、それらを効率的に３Ｄ表示し、基質結合に伴う誘導適合や、酵素反応による相互作用変化を解析する新規ツール群を新たに開発した。このツール群は、構造生物学など広く世界中の実験科学者に利用されているＰｙＭＯＬプログラムのＰｌｕｇＩｎとして開発されているため、新たなプログラムを学習する必要なしに利用でき、開発グループの異なる3種のＦＭＯプログラム(PAICS,ABINITMP,GAMESS)すべてに対して、統一的に利用できる。さらも同ツール群は、開発者のウエブページよりマニュアルとともにフリーダウンロード可能な形式で提供可能とした。これらの結果は、専門論文（J.Chem.Info.Model)などに公表し、詳細な説明と酵素などへの応用例については新たな発刊予定のFMO解説専門書籍の独立Chapterとして紹介される予定である。また、昨年度と同様に本研究におけるアプローチ手法の適用範囲を拡大するため、高選択有機化学反応の反応解析やタンパク質複合体の相互作用解析などについて適用し、それらに関しても、学会発表、論文等に成果として発表できている。今年度も順調に研究成果が積み上げられたが、論文の公表に関しては、サイエンス全体として、やはりトップジャーナル掲載への壁は厚く、専門雑誌への掲載に留まってしまった。今後は多点変異法などの新規バイオマティクス手法を加味して、機能性の向上だけなくこれまで達成されていない新規な活性を有する人工酵素の合理的設計創製に挑む。

Strategy for Future Research Activity

昨年までは、wild typeに対するapo-型初期構造への基質結合に伴う構造変化などの反応初期の解析が主な課題であった。今年度はそれらに加えてハイブリッド多層型計算に基づく反応経路解析などを行い、遷移状態、中間体などを含む反応経路解析を行った。現状では、酵素反応の各段階におけるすべての遷移状態の決定には至らなかったが、基質結合後の反応初期段階に対して、鍵となるアミノ酸相互作用を特定し、一部の遷移状態や中間状態を得ることができた。今後は、酵素活性の起源である選択性の発現に深く関連する反応後基質の脱離過程を含む酵素反応の全容解明に挑みたい。
さらに、構造を基盤としたwild typeのみに対する理論解析だけでなく、フルコンセンサス配列設計や祖先型配列設計など第四次革新的技術を利用したバイオインフォマティックスによる多点変異を導入した人工酵素を設計創製し、単なる活性向上ではなくこれまでになかった活性を有するなど、天然酵素をも凌駕する新たな産業応用酵素の創製に向けて、新規配列設計を行う。

Causes of Carryover

特になし

Research Products

• [Int'l Joint Research] スロバキア科学アカデミー(スロバキア)
  • Country Name: SLOVAKIA
  • Counterpart Institution: スロバキア科学アカデミー
• [Journal Article] Total Synthesis of Termicalcicolanone A via Organocatalysis and Regioselective Claisen Rearrangement (2019)
  • Author(s): Saki Ito, Taiki Kitamura, Sundaram Arulmozhiraja, Kei Manabe, Hiroaki Tokiwa, and Yumiko Suzuki
  • Journal Title: Organic Letters Volume: 21(8) Pages: 2777-2781
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.9b00731
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of analysis toolkit to visualize interaction energies generated by fragment molecular orbital calculations (2018)
  • Author(s): Takaki Tokiwa, Shogo Nakano, Yuta Yamamoto, Takeshi Ishikawa, Sohei Ito, Vladimir Sladek, Kaori Fukuzawa, Yuji Mochizuki, Hiroaki Tokiwa, Fuminori Misaizu, and Yasuteru Shigeta
  • Journal Title: J. Chem. Info. Model Volume: 59(1) Pages: 25-30
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.8b00649
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein residue networks from energetic and geometric data ? are they identical? (2018)
  • Author(s): Vladimir Sladek, Hiroaki Tokiwa, Hitoshi Shimano, Yasuteru Shigeta
  • Journal Title: J. Chem. Theor. Comp. Volume: 14(12) Pages: 6623-6631
  • DOI: 10.1021/acs.jctc.8b00733
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual conformation of the ligand induces the partial agonistic activity of retinoid X receptor α (RXRα) (2018)
  • Author(s): Yurina Miyashita, Nobutaka Numoto, Sundaram Arulmozhiraja, Shogo Nakano, Naoya Matsuo, Kanade Shimizu, Osamu Shibahara, Michiko Fujiwara, Hiroki Kakuta, Sohei Ito, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Hiroaki Tokiwa
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 593(2) Pages: 242-250
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.8b00427
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis, Biological Activities and X-ray Crystal Structural Analysis of 25-Hydroxy-25(or 26)-adamantyl-17-[20(22),23-diynyl]-21-norvitamin D Compounds (2018)
  • Author(s): Rocio Otero, Michiyasu Ishizawa, Nobutaka Numoto, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Hiroaki Tokiwa, Antonio Mourino, Makoto Makishima, and Sachiko Yamada
  • Journal Title: Journal of Medicinal Chemistry Volume: 61(15) Pages: 6658-6673
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.8b00427
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Benchmark analysis of native and artificial NAD+-dependent enzymes generated by a sequence based design method with or without phylogenetic data (2018)
  • Author(s): Shogo Nakano, Tomoharu Motoyama, Yurina Miyashita, Yuki Ishizuka, Naoya Matsuo, Hiroaki Tokiwa, Suguru Shinoda, Yasuhisa Asano, and Sohei Ito
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 57(26) Pages: 3722-3732
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.8b00339
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 種差の解消を指向したGPR35 アゴニストの合成研究 (2019)
  • Author(s): 永沼 美弥子, 渡邊 智博, 橋本知子、小出拓人、手塚一燈、橋本直季、赤木荘太、古田 和幸、山本雄大、長島颯太、常盤広明、田中智之、大野修、松野研司
  • Organizer: 日本薬学会第139年会、千葉
• [Presentation] 第四次革新的手法に基づくインフルエンザHA の変異予測からユニバーサルワクチン開発は可能となるか？ (2019)
  • Author(s): 山本雄大、Arulmozhiraja SUNDARAM、畑田 崚、中野 祥吾、伊藤創平、竹田誠、常盤広明
  • Organizer: 日本薬学会第139年会、千葉
• [Presentation] インフルエンザA 型ウイルスとスルファチドの結合分子機構の解析 (2019)
  • Author(s): 内野峻介、紅林 佑希、高橋忠伸、林野乃香、大石健太、常盤広明、鈴木 隆
  • Organizer: 日本薬学会第139年会、千葉
• [Presentation] Can novel sequence alignment method by 4th revolution predict critial mutational points in flu HAs? (2018)
  • Author(s): Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: Asian-Pacific Centenary Spanish 1918-flu Symposium, Shenzen, China
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular Simulation on Permeability of Middle-Sized Molecules across Lipid Bilayer Membrane (2018)
  • Author(s): Kanade Shimizu, Sundaram Arulmozhiraja, Yuta Yamamoto, Katsumi Maenaka, Satoshi Ichikawa, and Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: 10th Peptide International Symposium, Kyoto, Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Theoretical interaction analysis between nobiletin and muscarinic acetylcholine receptors using fragment molecular orbital (FMO) calculations (2018)
  • Author(s): Kanade Shimizu, Sundaram Arulmozhiraja, Yuta Yamamoto, WOO Je-Tae, Yasuo Watanabe, Shizuo Yamada, Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: The 4th International Conference on Pharma-Food (ICPF 2018) , Shizuoka Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Data Analysis Toolkits of Fragment Molecular Orbital Calculations to Visualize Interaction Energies Using the GUI Plugin for PyMOL (2018)
  • Author(s): Takaki Tokiwa, Shogo Nakano, Yuta Yamamoto, Takeshi Ishikawa, Sohei Ito, Kaori Fukuzawa, Yuji Mochizuki, Hiroaki Tokiwa, Yasuteru Shigeta
  • Organizer: Chem-Bio Informatics Society(CBI) Annual Meeting 2018, Funabori, Japan
• [Presentation] The extreme N-terminus of SLAM determines the fate of humans and monkeys against canine distemper virus infection (2018)
  • Author(s): Fumio Seki, Hideo Fukuhara, Yuta Yamamoto, Sundaram Alulmozhiraja, Shogo Nakano, Sohei Ito, Kazue Ohishi, Tadashi Maruyama, Shigeru Morikawa, Ryoji Yamaguchi, Hiroaki Tokiwa, Katsumi Maenaka, Makoto Takeda
  • Organizer: The 17th Awaji International Forum on Infection and Immunity, Awajishima, Japan
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] How to design artificial protein surpassing native enzyme function similar to Design and multidisciplinary analysis of artificial L-threonine 3-dehydrogenase (2018)
  • Author(s): Shogo Nakano, Tomoharu Motoyama, Yurina Miyashita, Yuki Ishizuka, Naoya Matsuo, Hiroaki Tokiwa, Suguru Shinoda, Yasuhisa Asano, Sohei Ito
  • Organizer: ASBMB Experimental Biology 2018 (San Diego, California), USA
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Discovery of novel monomeric L-threonine 3-dehydrogenase and elucidation of product release mechanism (2018)
  • Author(s): Tomoharu Motoyama, Shogo Nakano, Yuta Yamamoto, Hiroaki Tokiwa, Yasuhisa Asano, Sohei Ito
  • Organizer: ASBMB Experimental Biology 2018 (San Diego, California), USA
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] What is the origin of partial agonist activity of CBt-PMN for hRXRα? (2018)
  • Author(s): Kanade Shimizu, Yurina Miyashita, Yuta Yamamoto, Naoya Matsuo, Shogo Nakano, Sohei Ito, Nobutaka Numoto, Nobutoshi Ito, Hiroki Kakuta, Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: ASBMB Experimental Biology 2018 (San Diego, California), USA
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Computational design and molecular mechanism in oligomerization of C-terminal binding protein 2 (2018)
  • Author(s): Yurina Miyashita, Naoya Matsuo, Yuta Yamamoto, Shogo Nakano, Sohei Ito, Nobutaka Numoto, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Motohiro Sekiya, Hitoshi Shimano, and Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: ASBMB Experimental Biology 2018 (San Diego, California), USA
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Crystal structure of the tetrameric ligand binding domain of RXRalpha complexed with a novel synthetic partial agonist. (2018)
  • Author(s): Yurina Miyashita, Nobutaka Numoto, Sundaram Arulmozhiraja, Shogo Nakano, Naoya Matsuo, Kanade Shimizu, Osamu Shibahara, Michiko Fujiwara, Hiroki Kakuta, Sohei Ito, Teikichi Ikura, Nobutoshi Ito, Hiroaki Tokiwa
  • Organizer: The 56th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan (Okayama, Japan)
• [Presentation] Role for the extreme N-terminus of SLAM in determination of the moribillivirus host range (2018)
  • Author(s): Fumio Seki, Hideo Fukuhara, Yuta Yamamoto, Sundaram Alulmozhiraja, Shogo Nakano, Sohei Ito, Kazue Ohishi, Tadashi Maruyama, Shigeru Morikawa, Ryoji Yamaguchi, Hiroaki Tokiwa, Katsumi Maenaka, Makoto Takeda
  • Organizer: The 66th Annual Meeting of the Japansese Society of Viroglogy, Kyoto, Japan
• [Presentation] インフルエンザウイルスにおけるスルファチド結合部位の解析 (2018)
  • Author(s): 高橋忠伸、林野乃香、紅林佑希、大石健太、益田碧、川岸佐和子、藤田侑、常盤広明、鈴木隆
  • Organizer: 第60回脂質生化学会
• [Presentation] アミノ酸の配列データみを用いた高機能化酵素人工設計 (2018)
  • Author(s): 本山智晴、中野祥吾、宮下由里奈、石塚由貴、松尾直也、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • Organizer: 第19回ライフサイエンスシンポジウム、静岡
• [Presentation] 新規単量体型L-スレオニン脱水素酵素の発見と生成物脱離機構の解明 (2018)
  • Author(s): 本山智晴、中野祥吾、山本雄大、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • Organizer: 日本農芸化学会2018年度大会、名古屋
• [Presentation] 面糖タンパク質HN を標的とした抗ムンプスウイルス薬の合理的設計開発 (2018)
  • Author(s): 石川雄規、山本雄大、Sundaram Arulmozhiraja、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 高精度分子シミュレーションに基づく中分子化合物の脂質二重膜透過解析 (2018)
  • Author(s): 清水奏、Sundaram Arulmozhiraja、山本雄大、前仲勝実、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 第四次革新的手法を用いたモルビリウイルスと感染哺乳動物との共進化に関する理論的研究 (2018)
  • Author(s): 樋口玲爾、關文緒、中野祥吾、伊藤創平、丸山正、大石和恵、竹田誠、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] アミ配列を基盤としたNAD 依存型代謝センサー分子の解析 (2018)
  • Author(s): 宮下由里奈、中野祥吾、伊藤創平、沼本修孝、伊倉貞吉、伊藤暢聡、関谷元博、島野仁、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 新規アミノ酸配列解析手法による脂肪酸伸長酵素の構造および機能解析 (2018)
  • Author(s): 松田留理子、宮下由里奈、中野祥吾、伊藤創平、竹田浩之、松坂賢、島野仁、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 第一原理計算に基づく糖鎖－レクチン複合体の高精度相互作用解析 (2018)
  • Author(s): 増田匠吾、Sundaram Arulmozhiraja、隅田泰生、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] フェニルプロピオルアミド誘導体を用いたシス選択的なジアザジロ骨格の合成法の開発研究 (2018)
  • Author(s): 田口りか、神作美保子、橋爪優奈、横江弘雅、常盤広明、津吹政可
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 高精度第一原理計算を利用した GPR35 アゴニストの理論的相互作用解析 (2018)
  • Author(s): 長島颯汰、山本雄大、渡邊智博、 古田和幸、橋本知子、大野修、田中智之、松野研司、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 第一原理計算による脂質二重膜モデルの計算化学的解析 (2018)
  • Author(s): 畑田崚、山本雄大、松田留理子、清水奏、松坂賢、島野仁、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] レチノイドX 受容体(RXR)アゴニストの分子内回転による柔軟性に基づくRXR 誘導適合能に関する理論的解析 (2018)
  • Author(s): 伊藤匡史、今井大輔、宮下由里奈、加来田博貴、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] レチノイドX 受容体のパーシャルアゴニストCBTF-PMN の活性発現機構の解明に向けた構造学的研究 (2018)
  • Author(s): 今井大輔、清水奏、宮下由里奈、Sundaram Arulmozhiraja、中野祥吾、伊藤創平、沼本修孝、伊倉貞吉、伊藤暢聡、加来田博貴、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] シークヮーサー由来ノビレチンはなぜムスカリンM1 受容体選択的に結合するのか？ (2018)
  • Author(s): 山本雄大、清水奏、Sundarama Arulmozhiraja、杉山菜月、井出葵、禹済泰、渡邉泰雄、山田静雄、常盤広明
  • Organizer: 第62回日本薬学会関東支部大会、東京
• [Presentation] 核内受容体転写因子複合体におけるRXRαパーシャルアゴニストのPPI制御能に関する構造生物学,熱化学,および理論化学的解 (2018)
  • Author(s): 清水奏、宮下由里奈、中野祥吾、伊藤創平、沼本修孝、伊倉貞吉、伊藤暢聡、加来田博貴、常盤広明
  • Organizer: 創薬懇話会 in 志賀島、福岡
• [Presentation] サルならびにヒトのイヌジステンパーウイルスに対する感受性を決めるSLAM遺伝子変異 (2018)
  • Author(s): 關文緒、福原秀樹、山本雄大、Sundaram Alulmozhiraja、中野祥吾、伊藤創平、大石和恵、丸山正、森川茂、山口良二、常盤広明、前仲勝実、竹田誠
  • Organizer: 第90回日本遺伝学会、奈良
• [Presentation] 含窒素ヘテロ環式化合物の酵素法による合成への展開 (2018)
  • Author(s): 本山智晴、中野祥吾、山本雄大、常盤広明、浅野泰久、伊藤創平
  • Organizer: 日本生物工学会中部支部例会
• [Presentation] X 線結晶構造及び相互作用解析に基づく蛍光性 RXRα アゴニスト作用機序の解明 (2018)
  • Author(s): 川﨑真由, 中野祥吾, 本山智晴, 山田翔也, 渡邉将貴, 藤原美智子, 常盤広明, 加来田博貴, 伊藤創平
  • Organizer: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム、京都
• [Presentation] 新規代謝センサー分子CtBP2のアミノ酸配列に基づく分子設計と構造・物性評価 (2018)
  • Author(s): 宮下 由里奈, 山本 雄大, 中野 祥吾, 伊藤 創平, 沼本 修孝, 伊倉 貞吉, 伊藤 暢聡, 関谷 元博, 島野 仁, 常盤 広明
  • Organizer: 第36回メディシナルケミストリーシンポジウム、京都
• [Presentation] 配列を基盤としたバイオインフォマティックスによるモルビリウイルスと感染哺乳動物との共進化に関する理論的研究 (2018)
  • Author(s): 樋口 玲爾、關 文緒、中野 祥吾、伊藤 創平、丸山 正、大石 和恵、竹田 誠、常盤 広明
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会、横浜
• [Presentation] レクチン－糖鎖複合体に対する高精度第一原理計算の適用 (2018)
  • Author(s): 増田 匠吾, Sundaram Arulmozhiraja, 隅田 泰生, 常盤 広明
  • Organizer: 第37回日本糖質学会年会、仙台
• [Presentation] 多環式ベンザインによる付加環化反応の理論的反応解析 (2018)
  • Author(s): 山本雄大，井川貴詞，Arulmozhiraja Sundaram，Sladek Vladimir，松尾直也，村上智成，福元 豊，高木 晃，青山 浩，赤井周司，常盤広明
  • Organizer: 第16回次世代を担う有機化学シンポジウム、大阪
• [Presentation] 第一原理計算を利用した臨床治療薬の効能解析 (2018)
  • Author(s): 常盤広明
  • Organizer: ＣＢＩ学会２０１８年大会
  • Invited
• [Remarks] 立教大学理学部化学科理論創薬分子設計研究室
  • URL: www2.rikkto.ac.jp/web/tokiwa