１細胞遺伝子発現・力学動態の統合アプローチによる１個体発生原理の構成的理解

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17KT0021
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 近藤 武史 京都大学, 生命科学研究科, 特定助教 (60565084)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 覚 国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 基礎科学特別研究員 (80707836)
• Project Period (FY): 2017-07-18 – 2020-03-31
• Keywords: 形態形成 / ショウジョウバエ / １細胞RNA-seq

Outline of Annual Research Achievements

これまでにショウジョウバエ胚から単離した細胞とFluidigm社C1、次世代シークエンサーを用いた1細胞RNA RNA-seq技術を開発していたが、データ量・精度を上げるためにハイスループットチップと分子識別のためのUMIを使った手法の確立を行なった。それにより、一度の解析で400細胞以上の１細胞RNA-seqデータを得られるようになった。また、発現遺伝子数についても１細胞あたり平均4675遺伝子が検出できており、これまでに報告されているdrop-seqデータと比較してより多くの遺伝子が検出できている。主成分分析を行なったところ、背腹軸に沿った既知の空間遺伝子発現パターンで細胞が適切に分類されたことから、胚空間情報と矛盾のない高検出感度の１細胞RNA-seqデータが得られていると考えられた。
また、顕微鏡を用いたライブイメージングにより、細胞膜をラベルするGAP43-GFPおよび染色体をラベルするHistone-RFPを発現する胚を用いて１細胞レベルの三次元形態変化の過程の観察を行った。また、ライブイメージングにより抽出した胚全体の画像データから１細胞レベルの応力場を推定するため，その技術の核となる推定手法を構築・実装した。本手法では，三次元空間における多細胞組織の構造を，細胞境界面を単位とする三次元トポロジーにより近似する。さらに，胚発生を準静的な過程であると仮定し，このネットワークの頂点における力の釣合式を構築する。さらに，一般化逆行列を用いて，この連立方程式を解き，各細胞の応力状態の定量的な推定を実現した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

よりスループットと精度の高い１細胞RNA-seq手法を確立することができ、予定よりも多くの細胞データを取得できる目処がついた。また応力状態の推定のための画像データの取得と基盤技術の確立を進めた。

Strategy for Future Research Activity

１細胞RNA-seq解析については、報告されたdrop-seqデータよりもより高検出感度で情報量の多いデータセットとするために、新たに確立した手法を用いて合計1、500-2、000細胞程度のデータを取得し、胚三次元空間情報と紐付けする。三次元応力場の推定手法は、既に詳細な研究の行われている二次元の手法に基づいて開発している。しかし、二次元と三次元の推定手法には、空間次元に依存した自由度の違いがあるため、高精度な三次元の応力場の推定には、最適な自由度の粗視化が必要である。そこで、三次元バーテックスモデルにより作成した仮想的な三次元組織における三次元応力場を推定し、その精度の向上と妥当性の確認を行う。さらに、最適化を行った本手法を、実際のショウジョウバエ胚の画像データに対して適用し、各細胞の応力状態の定量的な推定を実現する。そして、空間情報を基準として１細胞遺伝子発現情報と細胞応力情報の統合データを構築し、多変量相関解析により両者の関係性を見出す。

Causes of Carryover

スループットと精度の高い１細胞RNA-seq手法の確立を進めたために計画していたシークエンス回数を行うことができなかったが、次年度にはこの確立した手法によりシークエンスを行い、当初の計画よりも多くのデータを取得するために使用する予定である。