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2017 Fiscal Year Research-status Report

光受容体タンパク質が自発的に作る2次元秩序構造についての構成的研究

Research Project

Project/Area Number 17KT0024
Research InstitutionKobe University

Principal Investigator

森垣 憲一  神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 林 文夫  神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
山下 隼人  大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (10595440)
粟津 暁紀  広島大学, 理学研究科, 准教授 (00448234)
Project Period (FY) 2017-07-18 – 2020-03-31
Keywords生体膜 / 受容体 / ラフト
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。これまでの研究から、ラフト領域(秩序液晶相:lo相)と非ラフト領域(無秩序液晶相:ld相)をパターン化した人工膜を開発し、Rhの脂質ラフトへの親和性をlo/ ld相への分配から定量的に評価することに成功した。この技術を発展させ、ラフト領域の脂質組成やRh濃度を調節することで、人工膜にRh超分子クラスターなどの2次元秩序構造を再構成する。平成29年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する技術開発を行った。
①パターン化人工膜の作製:ガラス基板に流動性脂質膜(100%生体脂質)と部分重合膜(生体脂質とポリマー脂質の混合膜)を持つパターン化膜を作製し、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製した。
②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成:パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))の再構成を行った。
③Rh超分子クラスターの形成:円板膜を再構成して、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の観察に成功した。ただし、観察像をGtと特定するにはデータが弱いため、今後、暗室中で①Rhのみ②Gt添加③光照射④GTP添加、の条件で、①Gtがみられない、②Gtが動き回っている、③GtがRh上で止まる、④Gtが動き始める、という像を確認する。
④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルの構築:粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現した。ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量し、クラスター形成を評価した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。平成29年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する基盤技術の開発を行うことができた。①パターン化人工膜の作製では、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製する技術を改良し、定量性を改善した。②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))を機能を保持した形で再構成する技術を開発した。③Rh超分子クラスターの形成では、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体を高速AFMで観察することに成功した。特に、Rhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察することに成功した。④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現し、ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量してクラスター形成を評価した。以上の結果は、視細胞円板膜の2次元秩序を人工膜に再構成し、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションで詳細に解析することで、自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な基盤となる。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は、以下の検討を行うことで、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する技術を開発したい。
①パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成:2次元秩序構造形成にはRh二量体が重要であると考えられるため、導入条件(界面活性剤濃度、希釈率、攪拌、脂質組成など)を改善することで、Rhを二量体形成に必要な密度(およそ100分子/平方マイクロメートル以上)で再構成することを試みる。Rh拡散、二量体形成を観測して導入条件を最適化する。
②Rh超分子クラスターの形成:超分子クラスターの動的形成過程、分子集合状態、二量体、オリゴマーとの平衡を、1分子蛍光観察および高速AFMを用いて詳細に観察する。
③Rh超分子クラスターの機能解析:高速AFMを用いてRh超分子クラスターを暗中で観察しながらRh分子を光活性化し、Rh分子の構造と集合状態の変化を調べる。暗室中で、Rhのみ、Gt添加、光照射、GTP添加、の条件で、(1) Gtがみられない、(2) Gtが動き回っている、(3) GtがRh上で止まる、(4) Gtが動き始める像を得ることを目指す。
④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルの構築:平成29年度に引き続き、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現する。Rh 凝集状態(単量体~多量体)に応じてラフト、非ラフト脂質への親和性が変化する、Rh凝集体の解離定数が周辺の脂質組成によって影響されると仮定して、これらの寄与の重みを変えつつシミュレーションを行い、Rh超分子クラスター形成を考察する。

Causes of Carryover

本研究で整備・使用する顕微鏡において、一部の光学部品導入を次年度に導入することとしたため、一部の助成金を繰り越しました。当該繰越金は、翌年度分として請求した助成金と合わせ顕微鏡光学系整備、高速AFMを用いたロドプシン計測のための整備などに使用する予定です。

  • Research Products

    (24 results)

All 2018 2017 Other

All Journal Article (8 results) (of which Peer Reviewed: 8 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 8 results,  Invited: 11 results) Book (1 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Journal Article] Evolution and development of model membranes for physicochemical and functional studies of the membrane lateral heterogeneity2018

    • Author(s)
      Morigaki Kenichi、Tanimoto Yasushi
    • Journal Title

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes

      Volume: 1860 Pages: 2012~2017

    • DOI

      10.1016/j.bbamem.2018.03.010

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Inhibitory effect of several sphingolipid metabolites on calcineurin2018

    • Author(s)
      Maruyama Yoko、Ueno Satoko、Morita Mitsuhiro、Hayashi Fumio、Maekawa Shohei
    • Journal Title

      Neuroscience Letters

      Volume: 673 Pages: 132~135

    • DOI

      doi.org/10.1016/j.neulet.2018.03.010

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Combined pulsed laser deposition and non-contact atomic force microscopy system for studies of insulator metal oxide thin films2018

    • Author(s)
      Katsube Daiki、Yamashita Hayato、Abo Satoshi、Abe Masayuki
    • Journal Title

      Beilstein Journal of Nanotechnology

      Volume: 9 Pages: 686~692

    • DOI

      doi:10.3762/bjnano.9.63

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hybrid Model Membrane Combining Micropatterned Lipid Bilayer and Hydrophilic Polymer Brush2017

    • Author(s)
      Nishimura Toshiki、Tamura Fuyuko、Kobayashi Sawako、Tanimoto Yasushi、Hayashi Fumio、Sudo Yuki、Iwasaki Yasuhiko、Morigaki Kenichi
    • Journal Title

      Langmuir

      Volume: 33 Pages: 5752~5759

    • DOI

      10.1021/acs.langmuir.7b00463

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Raft-based sphingomyelin interactions revealed by new fluorescent sphingomyelin analogs2017

    • Author(s)
      Kinoshita Masanao、Suzuki Kenichi G.N.、Matsumori Nobuaki、Takada Misa、Ano Hikaru、Morigaki Kenichi、Abe Mitsuhiro、Makino Asami、Kobayashi Toshihide、Hirosawa Koichiro M.、Fujiwara Takahiro K.、Kusumi Akihiro、Murata Michio
    • Journal Title

      The Journal of Cell Biology

      Volume: 216 Pages: 1183~1204

    • DOI

      10.1083/jcb.201607086

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The Role of the Prod1 Membrane Anchor in Newt Limb Regeneration2017

    • Author(s)
      Nomura Kaoru、Tanimoto Yasushi、Hayashi Fumio、Harada Erisa、Shan Xiao-Yuan、Shionyu Masafumi、Hijikata Atsushi、Shirai Tsuyoshi、Morigaki Kenichi、Shimamoto Keiko
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 56 Pages: 270~274

    • DOI

      doi.org/10.1002/anie.201609703

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Palmitoylation is a prerequisite for dimerization-dependent raftophilicity of rhodopsin2017

    • Author(s)
      Seno Keiji、Hayashi Fumio
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 292 Pages: 15321~15328

    • DOI

      10.1074/jbc.M117.804880

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Dynamic changes in the interchromosomal interaction of early histone gene loci during development of sea urchin2017

    • Author(s)
      Matsushita Masaya、Ochiai Hiroshi、Suzuki Ken-ichi T.、Hayashi Sayaka、Yamamoto Takashi、Awazu Akinori、Sakamoto Naoaki
    • Journal Title

      Journal of Cell Science

      Volume: 130 Pages: 4097~4107

    • DOI

      doi: 10.1242/jcs.206862

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Patterned model biological membrane on the solid substrate2018

    • Author(s)
      Morigaki, K.
    • Organizer
      9th International Workshop on Nanostructures and Nanoelectronics
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Nanometric gap structure for selective biosensing created with patterned lipid bilayer, silicone elastomer, and silica nanoparticles2018

    • Author(s)
      Morigaki, K., Tanabe, M., Komatsu, R., Ando, K.
    • Organizer
      255th American Chemical Society National Meeting
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Hybrid model membrane combining micropatterned lipid bilayer and hydrophilic polymer brush2017

    • Author(s)
      Morigaki, K., Nishimura, T., Tamura, F., Kobayashi, S., Tanimoto, Y., Sudo, Y., Hayashi, F., Iwasaki, K.
    • Organizer
      253rd American Chemical Society National Meeting
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 人工膜を用いた膜シグナル伝達機構の再構成と定量的解析2017

    • Author(s)
      森垣憲一
    • Organizer
      理研シンポジウム「細胞システムの動態と論理 IX」
    • Invited
  • [Presentation] Micropatterned model membrane to elucidate the functional roles of lipid micro-domains in the signal transduction cascade2017

    • Author(s)
      Morigaki, K.
    • Organizer
      Tethmem 2017
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Model membrane on a solid substrate: Crawling to grow from 2D into 3D structures2017

    • Author(s)
      Morigaki, K.
    • Organizer
      BioNano summer school
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Model membrane on the solid substrates with increased complexity and functions2017

    • Author(s)
      Morigaki, K.
    • Organizer
      International Symposium on Science and Technology of Molecular Assemblies for Biomaterials Innovation
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Patterned lipid bilayer on solid substrate as a versatile model system of biological membrane2017

    • Author(s)
      Morigaki, K.
    • Organizer
      3rd International Conference on Bioinspired and Zwitterionic Materials
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Reconstitution and quantitative analyses of membrane signal transduction by using micropatterned model system2017

    • Author(s)
      Morigaki, K., Tanimoto, Y., Kojima, S., Awazu, A., Hayashi, F.
    • Organizer
      ConBio 2017
    • Invited
  • [Presentation] 生細胞膜分子イメージングのための高速AFMスキャナーの開発2017

    • Author(s)
      山下隼人, 田岡東, 福森義宏, 阿部真之
    • Organizer
      第78回応用物理学会秋季学術講演会
  • [Presentation] Molecular imaging on living bacterial cell surface by high speed AFM2017

    • Author(s)
      Hayato Yamashita, Azuma Taoka, Yoshihiro Fukumori, and Masayuki Abe
    • Organizer
      第55回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] High speed AFM imaging under controlled temperature2017

    • Author(s)
      Hayato Yamashita, Kyosuke Kato, and Abe Masayuki
    • Organizer
      The 8th International Symposium on Surface Science
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Molecular imaging on living bacterial cell surface by high speed AFM2017

    • Author(s)
      Hayato Yamashita, Azuma Taoka, Yoshihiro Fukumori, Masayuki Abe
    • Organizer
      ConBio2017
    • Invited
  • [Book] 生産と技術2017

    • Author(s)
      山下隼人
    • Total Pages
      9
    • Publisher
      一般社団法人生産技術振興協会
    • ISBN
      ISSN-0387-2211
  • [Remarks] 神戸大学 環境物質科学

    • URL

      http://www.research.kobe-u.ac.jp/rceg-nowstone/index.html

  • [Patent(Industrial Property Rights)] スキャナ及び走査型プローブ顕微鏡2017

    • Inventor(s)
      山下隼人、阿部真之
    • Industrial Property Rights Holder
      国立大学法人大阪大学
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2017/044060
    • Overseas

URL: 

Published: 2018-12-17  

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