2019 Fiscal Year Research-status Report
光受容体タンパク質が自発的に作る2次元秩序構造についての構成的研究
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17KT0024
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
森垣 憲一 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (10358179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 文夫 神戸大学, 理学研究科, 名誉教授 (80093524)
山下 隼人 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (10595440)
粟津 暁紀 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 准教授 (00448234)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2021-03-31
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| Keywords | 生体膜 / ロドプシン / オリゴマー / 人工膜 / 高速AFM / ラフト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。これまでの研究から、ラフト領域（秩序液晶相：lo相）と非ラフト領域（無秩序液晶相：ld相）をパターン化した人工膜を開発し、Rhの脂質ラフトへの親和性をlo/ ld相への分配から定量的に評価することに成功した。この技術を発展させ、ラフト領域の脂質組成やRh濃度を調節することで、人工膜にRh超分子クラスターなどの2次元秩序構造を再構成する。2019年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する研究を行った。①パターン化人工膜作製では、ガラス基板に流動性脂質膜（100％生体脂質）と部分重合膜（生体脂質とポリマー脂質の混合膜）を持つパターン化膜を作製し、ラフト領域（lo相）および非ラフト領域（ld相）とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製した。
②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体（Rh）をより高効率で導入することを目的として、円板膜ベシクルを用いた導入、円板膜を界面活性剤で一部可溶化させ、ロドプシン凝集体を安定化させる手法の検討などを行った。③Rh超分子クラスターの形成は、円板膜より再構成した膜を高速AFMで観察し、完全暗黒下でRhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の観察に成功した。④数理モデルの構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現してロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量し、クラスター形成を評価した。以上の研究成果により、円板膜におけるロドプシン光受容体の2次元秩序構造が光シグナル伝達に果たす役割について重要な知見を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。2019年度には、①パターン化人工膜作製、②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、③Rh超分子クラスターの形成、④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する基盤技術の開発を行うことができた。①パターン化人工膜の作製では、ラフト領域（lo相）および非ラフト領域（ld相）とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製して、光シグナル伝達に関わる分子群のラフト親和性を定量した。②パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体（Rh）をより高効率で導入することを目的として、円板膜ベシクルを用いた導入、円板膜を界面活性剤で一部可溶化させ、ロドプシン凝集体を安定化させる手法の検討などを行った。③Rh超分子クラスターの形成では、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体を完全暗黒下で高速AFMで観察することに成功し、Rhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察した。④膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現し、ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量してクラスター形成を評価した。以上の結果は、視細胞円板膜の2次元秩序を人工膜に再構成し、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションで詳細に解析することで、自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な基盤となる。粗視化分子動力学シミュレーションの結果については、論文を発表した。今後、1分子蛍光観察および高速AFMの結果について解析を進め論文発表を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの人工膜、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションによる検討より、視細胞円板膜の自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な知見を得てきた。粗視化分子動力学シミュレーションの結果については、これまでの結果をまとめて論文を発表した。2020年度には、1年間研究期間を延長して、1分子蛍光観察および高速AFMの結果について解析を進め論文発表を目指す。具体的には、円板膜ベシクル、円板膜を界面活性剤で一部可溶化させた状態などを活用して、ロドプシンを高密度で再構成し、また、凝集体を安定化させる手法を検討する。そして、これまでの検討で確立している1分子蛍光観察、および完全暗黒下での高速AFM観察技術を利用して、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の膜内での動きやRhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察しその動態を詳細に解析する。以上の検討を通じて、2次元秩序構造の形成原理と機能を構成的に理解することをめざす。
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| Causes of Carryover |
これまでの人工膜、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションによる検討より、視細胞円板膜の自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な知見を得てきた。粗視化分子動力学シミュレーションの結果については、これまでの結果をまとめて論文を発表した。2020年度には、1年間研究期間を延長して、1分子蛍光観察および高速AFMの結果について解析を進め論文発表を目指す。使用計画としては、追加検討のための試料購入、顕微鏡光学系の追加整備、論文投稿料などを予定している。
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