2019 Fiscal Year Research-status Report
深層学習による疾患の超早期発見を可能にする病態発症前モデルの大規模スクリーニング
| Project/Area Number |
17KT0049
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
越智 陽城 山形大学, 医学部, 准教授 (00505787)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2021-03-31
|
| Keywords | ネッタイツメガエル / 癌ドライバー遺伝子 / CRISPR-Cas9 / 腫瘍形成 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
発癌の分子機構についてはこれまで多くの研究が行われてきたが、近年の研究の結果から、腫瘍形成は単一の癌抑制遺伝子の変異ではなく複数の遺伝子変異の蓄積によりその確率が大きく上昇するという、いわゆるマルチヒット仮説が提唱されている。実際、大腸癌においては、APC・P53、k-ras、Smad4.1という4遺伝子の変異が時間とともに蓄積し、これが腫瘍の悪性化を引き起こすことが知られている。しかしながら、他の癌における原因遺伝子変異のセットの違いも含め、未同定の組合せが多く残されていることが想像される。このような癌ドライバーセットを多数同定することができれば、逆に癌の未発症状態を知ることができ、疾病予測の実現にもつながることが期待できる。そこで本研究では、一度に多数の腫瘍形成個体をスクリーニングできるネッタイツメガエルをモデル生物に用い、CRISPR-Cas9の実験系を用いて複数の癌関連遺伝子を同時に変異導入することで、癌形成に関わる遺伝子の新しい組合せを網羅的に見出すことを実験目的としている。これまでに、カエル胚に複数のgRNAをCas9タンパク質とともに導入し、2週程度成長させた幼生の外形を観察することで、腫瘍形成個体のスクリーニング系を確立してきた。2019年度においては、昨年度に引き続きAPC・P53、k-ras、Smad4.1等に対するgRNAをネッタイツメガエルの2細胞胚に微量注入して発生を進め、腫瘍化個体をスクリーニングしてきた。本年度大きく進捗したのはその導入効率そのものであり、n数が少ないものの、4遺伝子導入時の変異導入効率が6割以上となった。また、いくつかの腫瘍形成個体も観察された。腫瘍形成個体のスクリーニングがようやく効率よくできるようになり、来年度一年期間を延長することにより、新しい変異組合せの取得を目指す。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2019年度は引き続きapc, p53,kras,smad4.1の4種のgRNAを混合したカクテルをインジェクションし、当該領域のゲノムシーケンスによる変異導入効率を調べるとともに、腫瘍形成個体のスクリーニングを継続して行った。まず変異導入については、昨年度はkrasのみの変異導入しか確認できなかったが、本年度はapc, p53についても変異導入が確認された。特に今年度においては、同一個体において複数の遺伝子の同時破壊を確認することができた。この結果は、ようやく本プロジェクトがカクテルインジェクションによりドライバー遺伝子セットを探索でき可能性を向上させた。一方で、複数回の実験によってもsmad4.1の変異導入を確認することができなかった。理由は不明であるが、ゲノムの構造的な問題、すなわちgRNAによる攻撃を受けにくい配列であった可能性があった。そのため、smad4.1については新たなgRNAを作成し、現在変異導入ができるかどうかを確かめている。さらに当該年度の後半においては、技術の向上など様々な要因の結果、複数遺伝子に対するgRNA導入時の変異導入効率が大きく向上したことにある。ｎ数はそれほど大きくないが、4種類のgRNAを同時に導入した際、3種類同時に破壊できている個体が6割程度見られるようになった。このことは、カクテルインジェクションが実験上実現可能であることを意味しており、プロジェクトの大きな進捗と捉えることができる。さらに、腫瘍形成個体についても頭部が肥大するような個体を得ることに成功しており、来年度の大規模なスクリーニング実施に向けて、大きな足がかりとなった。さらに今年度は、別途癌形成に関与すると思われる、キャンサーパネルに含まれない別の遺伝子の検討を開始した。これについては来年の結果が待たれる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
進捗が若干遅れ気味であるが、昨年度の結果を受け、研究期間を1年間延長し、以下の内容について研究を行う予定である。(1)昨年度から行っている、既知の組合せの癌ドライバーに対するgRNAカクテルを微量注入し、約2週間成長させた個体について腫瘍化個体スクリーニングを行うことを継続して実施する。スクリーニング個体数（スクリーニング数は約10000を予定している）を増やすことで、腫瘍化がどの程度の頻度で生じるか、各遺伝子の変異導入効率がどれくらいかについて、定量的なデータを得る。また、今年度は可能であればgRNA/Cas9を注入する領域を区別することで、形成させる腫瘍の種類をある程度コントロールすることも考える。
(2)今年度は、20カクテルのインジェクションと腫瘍化個体のスクリーニングをようやく進めることができる状況になったため、これを大規模に進める。カクテル用の遺伝子の選定についても、当初予定通りキャンサーパネルから選択した上で、使用可能となったネッタイツメガエルの各系統独自に解析されたゲノムデータを元に、現在使っている系統に最適化したgRNA設計を行うことで、破壊個体取得の効率化を図る。
(3)別の実験から明らかになった、腫瘍化に関係する遺伝子については、昨年度にgRNAの設計は終わっているため、この遺伝子に対するgRNAのみを微量注入することで表現型を確認した上で、上記のカクテルに加え腫瘍形成頻度が上昇するかどうかを検討することで、1遺伝子の有無による腫瘍形成に与える影響の実例を示す。
(4)(1)、(2)の研究の進展状況にもよるが、これも昨年度はできなかった、得られた個体のゲノムを増幅するためPCRのプライマーにバーコードを入れることで、各増幅断片を一つに混合したサンプルから同時に1回でシーケンスする手法も確立したい。
|
| Causes of Carryover |
本研究はネッタイツメガエル胚にCRISPR-Cas9を導入することで発癌ドライバー遺伝子を破壊し腫瘍化個体を得るプロジェクトであったが、当初遺伝子の破壊がうまく行かず、研究の進捗が遅くなった。ただ、今年度に入り複数の遺伝子同時破壊が効率よく出来るようになり、あと一年研究期間を延長すれば、研究が大きく伸展し当初計画に近い結果を得ることが期待できるようになったため、一年間の補助期間延長申請を行い（すでに承認済み）、残額を用いて研究を遂行することとした。
|
-
-
-
-
-
-
-
-
[Book] 生物学入門 第三版2019
Author(s)
嶋田正和、上村慎治、増田建、道上達男（編）
Total Pages
298
Publisher
東京化学同人
ISBN
9784807909520
