2020 Fiscal Year Research-status Report
深層学習による疾患の超早期発見を可能にする病態発症前モデルの大規模スクリーニング
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17KT0049
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
越智 陽城 山形大学, 医学部, 准教授 (00505787)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2022-03-31
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| Keywords | 癌ドライバー遺伝子 / ネッタイツメガエル / CRISPR-Cas9 / 癌形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
発癌の分子機構についてはこれまで多くの研究が行われてきたが、近年の研究の結果から腫瘍形成は単一の癌抑制遺伝子の変異ではなく複数の遺伝子変異の蓄積によりその確率が大きく上昇するという、いわゆるマルチヒット仮説が提唱されている。例えば、大腸癌においては、APC・P53、k-ras、Smad4.1、以上4遺伝子の変異が時間とともに蓄積し、これが腫瘍の悪性化を引き起こすことが知られている。しかし、未同定の癌ドライバー遺伝子セットがまだ多く残されていることが期待される。このような遺伝子セットを多数同定することができれば、癌の未発症状態が把握でき、疾病予測にもつながることが期待できる。そこで本研究では、一度に多数の腫瘍形成個体をスクリーニングできるネッタイツメガエルをモデル生物に用い、CRISPR-Cas9の実験系を用いて複数の癌関連遺伝子を同時に変異導入することで、新規癌ドライバー遺伝子セットを網羅的に見出すことを実験目的とした。これまで、複数のgRNAをCas9タンパク質とともに導入し発生させた２週幼生の外形観察により腫瘍形成個体のスクリーニング系を確立し、これまでに4遺伝子の変異導入効率が6割以上となっている。また、少ないながらも実際に腫瘍形成個体も観察されている。現在も継続して腫瘍形成個体のスクリーニングを行うとともに、複数gRNAの注入による生存率の変化を調べることで系の改善を試みているが、腫瘍形成個体の作出頻度の改善が見られないことから別のアプローチでの遺伝子セット探索を並行して行っている。NBRPにおける大量飼育において、あるコロニーで自然誘発的な腫瘍形成個体が高頻度に出現することが見出された。そこで、腫瘍形成個体の腫瘍部・非腫瘍部からRNAを抽出して遺伝子の発現を調べ、その結果を遺伝子破壊系にフィードバックすることで、新規癌ドライバーセットの同定を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1) 2020年度も引き続きapc, p53,kras,smad4.1の4種のgRNAを混合したカクテルをインェクションし、当該領域のゲノムシーケンスによる変異導入効率を調べるとともに、腫瘍形成個体のスクリーニングを行った。ただ、現在のコロナ禍の状況のため大規模な実験が難しかったこともあり、腫瘍形成個体の出現頻度が低い問題が十分には改善できていない。その理由の一つとして、APCやP53のノックアウトを発生初期に行うことによる発生への影響が考えられため、注入個体の致死率を調べたところ、1-２細胞期でのインジェクションに比べ８細胞期での注入致死率が高いことを見出した。
2)広島大両生類研で多数飼育されているネッタイツメガエルにおいて、複数の腫瘍形成個体が確認されることが分かっていた。そこで、これらの個体の系統関係を調べたところ、あるコロニー（同一の親由来の個体群）における出現頻度が高いことが明らかになった。そこで、腫瘍形成個体7個体からRNAを抽出し、既存の癌抑制遺伝子の発現を調べた。その結果、NC系のコロニーに属する2個体はいずれもTP53が、IC系のコロニーに属する2個体はいずれもSmad4.1の発現が劇的に上昇していることが分かり、得られた組織が腫瘍組織である可能性を強く示唆した。現在、腫瘍組織における遺伝子発現の状況を網羅的に調べるため、代表する２個体についてRNAseq解析を開始した。
(3) 別の文脈で腫瘍形成に関わることが示唆されている新規遺伝子（geneAとする）についてgRNAの微量注入による表現型を観察したところ、頭部形成、あるいは目の形成に異常をきたす個体が多く得られたが、現在のところ腫瘍形成個体の獲得には至っていない。ただ、上述の腫瘍形成個体においてgeneAの発現が上昇していることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
コロナ禍の影響により、研究期間を更に1年間延長して以下の内容について研究を行う。
(1) 現在、腫瘍化個体２個体から得たRNAを用い、RNAseqを行っている。この結果から、腫瘍個体における腫瘍部と非腫瘍部間での遺伝子発現の違い、あるいは腫瘍形成個体と非腫瘍形成個体間での発現の違いを調べる。得られた結果から、それぞれの腫瘍、あるいは腫瘍形成個体においてどのような遺伝子ネットワークが起動しているかをオントロジー解析なども利用しながら調べ、原因となる遺伝子変異を類推する。これについては、改めてガイドRNAを設計して腫瘍形成能の有無を調べる。また、この際にTP53、APCの共注入により腫瘍化形成能が促進するかどうかも同時に解析する。さらに、腫瘍形成個体については、遺伝子の配列そのものの解析も行い、直接的な原因も探る。
(2)これまで用いてきた癌ドライバーgRNAカクテルを微量注入した個体について腫瘍化個体スクリーニングを今年度も継続して実施する。gRNAによるゲノム編集のタイミングに問題がある可能性が示唆されたため、Cas9タンパク質をコンディショナルに発現させることができるベクターを構築し、より発生が進んだタイミング（例えば神経胚以降）にゲノム編集を駆動させることにより、腫瘍化形成個体の出現頻度の改善を目指す。
(3)腫瘍形成に関わるgeneAについては、geneA gRNAの注入による腫瘍形成能を調べるとともに、他の癌抑制遺伝子の発現変化を調べる。また、TP53 gRNA、あるいはAPC gRNAとの共注入によって腫瘍形成が促進するかどうかを検証する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍による影響のため、研究期間を再度１年間延長して研究業績を出す予定である。
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