2017 Fiscal Year Research-status Report
Fundamental analysis for the bottom-up type reconstitute of RNA transport across the nuclear pore complex
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17KT0113
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉久 徹 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60212312)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2020-03-31
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| Keywords | 核―細胞質間輸送 / RNA / nucleoporin / ヒドロゲル / 透過障壁 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
核膜孔は、約60 kDa以下の分子の自由拡散とより大きな分子の能動輸送とを双方向的に司る輸送装置である。近年、核膜孔構成タンパク質Nupの形成するヒドロゲルが透過障壁、能動輸送場の両方のコアとなることが、タンパク質を輸送基質とした解析で判ってきた。しかし、RNAの輸送に関してNupの果たす役割の研究は遅れていた。そこで申請者は、RNAの核-細胞質間輸送の理解のため、輸送の方向性を再現できるRNA輸送のin vitro系構築をボトムアップ的に進めた。本研究計画では、１）様々なRNAに対して透過障壁となるNupヒドロゲルの作成、２）輸送担体依存の核外・核内双方向の輸送が知られているtRNAについて、その能動輸送を反映する特性をNupゲルが持つかの検討、３）Nupゲル薄膜を用い、方向性を持った輸送を再現できる再構成系の構築、４）Nupの特性を反映した化学構造のより単純な人工ゲルの開発とゲルが必要とする構造特性の解明、の４点に関して構成的システム生物学的な解析を展開する。
本年度はその第１段階として、Nupヒドロゲル形成のための複数のNup（Nsp1、Nup49、Nup100、Nup116）のFGリピート領域の精製、また、能動的輸送の再現に必要な出芽酵母のRan GTP結合タンパク質や関連因子（Gs1p1p、Rna1p、Prp10p）、tRNAの核外輸送因子Los1p、核内輸送因子Ssa2pなどの精製を進めた。さらに、精製したNupを用いてヒドロゲル形成の条件検討を行った。合わせてtRNAの核膜孔透過を再現するのに必要なtRNAの細胞内濃度を決定するため、酵母の各tRNA種の絶対量を定量する手法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本課題が年度途中から発足したため、研究課題に学生を適切にアサインすることが出来ず、限られた人的資源で研究を進めざるを得なかった。そのため、前述の様に必要なタンパク質群の精製手法の確立、精製の実施、ヒドロゲル作製の条件検討の段階に到達したに留まった。H30年度は適切な人材配置ができており、予定の遅延を取り戻し、H30年度以降の研究計画を推進できる体制が整った。まずは、Nupヒドロゲルブロックを用いたRNAの浸潤アッセイを行い、NupゲルのRNAに対する透過障壁能の解析以下の実験計画を遂行する。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述の様に人的資源配置の問題で当初の計画に対して多少の遅れがあるので、それを取り戻すべく、今年度は研究の進捗を急ぐ予定である。研究材料に関しては揃いつつあるため、当初の計画を順次進めることとする。なお、NupヒドロゲルへのRNAの浸潤アッセイの結果がある意味、その後の研究計画の可否に関してキーとなるデータを与える。その時点で、以降の研究展開の修正が必要かどうかの判断する予定である。
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