2019 Fiscal Year Annual Research Report
Fundamental analysis for the bottom-up type reconstitute of RNA transport across the nuclear pore complex
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17KT0113
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉久 徹 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60212312)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2020-03-31
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| Keywords | 核-細胞質間輸送 / RNA / nucleoporin / ヒドロゲル / 透過障壁 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
核膜孔は、約60 kDa以下の分子の自由拡散とより大きな分子の能動輸送とを双方向的に司る輸送装置である。近年、核膜孔構成タンパク質Nupの形成するヒドロゲルが透過障壁、能動輸送場の両方のコアとなることが、タンパク質を輸送基質とした解析で判ってきた。しかし、RNAの輸送に関してNupの果たす役割の研究は遅れていた。そこで申請者は、RNAの核-細胞質間輸送の理解のため、輸送の方向性を再現できるRNA輸送のin vitro系構築をボトムアップ的に進めた。本研究計画では、１）様々なRNAに対して透過障壁となるNupヒドロゲルの作成、２）輸送担体依存の核外・核内双方向の輸送が知られているtRNAについて、その能動輸送を反映する特性をNupゲルが持つかの検討、３）Nupゲル薄膜を用い、方向性を持った輸送を再現できる再構成系の構築、４）Nupの特性を反映した化学構造のより単純な人工ゲルの開発とゲルが必要とする構造特性の解明、の４点に関して構成的システム生物学的な解析を展開する。
本年度は昨年度に引き続き、出芽酵母由来の複数のNup（Nsp1、Nup49等）を精製し、これら用いてヒドロゲル形成の条件検討を行うとともに、独自に開発した定量法によってtRNAの核膜孔透過を再現するのに必要なtRNAの細胞内濃度が0.6~13 μMであることを明らかにした。このヒドロゲル形成実験において、ゲル形成前の高濃度のNup組換えタンパク質溶液が変性剤存在下でも高粘性であるため薄膜作製が不可能であることが判った。他方、フェニル基を含むアクリルアミド誘導体（ベンジルアクリルアミド）の合成法を確立し、アクリルアミドとのコポリマー形成を試みた。しかし、この誘導体の疎水性の問題で水中でのコポリマー形成が不可能であり、極性混合溶媒中で形成したポリマーの溶媒交換が必要であることが明らかとなった。
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