2017 Fiscal Year Research-status Report
藻食性魚類腸管内微生物の有効活用を目指した海洋生物資源利用に関する基礎的研究
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17KT0148
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
秋吉 英雄 島根大学, 生物資源科学部, 准教授 (20150360)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 真明 島根大学, 生物資源科学部, 准教授 (50555498)
川向 誠 島根大学, 生物資源科学部, 教授 (70186138)
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| Project Period (FY) |
2017-07-18 – 2020-03-31
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| Keywords | 藻食性魚類 / 消化器官 / 腸内微生物叢 / アンプリコン解析 / 培養 / 16s RNA / 16s DNA / ヨダレカケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一般的に藻食性魚類と記載されている魚種を解剖学的に観察，組織学標本を作製して網羅的に検討，腸内微生物を共生させる海藻・珪藻食性魚類の消化器官の特徴を明らかにした．藻食性魚類は，雑食性の魚種のなかでも藻類食に特化した特異なタイプと考えられ（秋吉英雄，消化器官「魚類学の百科辞典」第3章p136-139，丸善出版，2018），実際には海藻・珪藻に食性が限定されている魚種は非常に少ない結果を得た．腸管内微生物叢のDNA解析および培養に適した魚種として，今回スズキ目イソギンポ科のヨダレカケ（南西諸島）カエルウオ，ヘビギンポ（山陰海域）の3種を候補魚種として供した．
研究分担者の吉田は，この3種の腸内細菌叢のアンプリコン解析を行った．今回は既知のプロトコルに基づき，腸内容物のDNAから16SrRNAのV3-4領域を増幅して網羅的配列解読を行い，各サンプルから95000～120000本の配列データを得た．解析モジュールQIIME2を用いて予備的解析を行い，1048本の代表的な細菌の配列と各サンプルにおける頻度を得ることができた．
研究分担者の川向は，3種の中でも藻食性魚類ヨダレカケに注目し，腸内微生物を単離，その菌種の同定を試みた．腸内容液を直接LB培地で培養して8株（LB1-LB8）を単離，Zobell培地で培養して9株(ZO1-ZO9)を得た．それぞれの株の16SrDNA領域を増幅し，DNA配列を決定した．その結果，LB1, LB2, LB4, LB6株はVibrio属の細菌に属すると推定され，LB3はShewanella属，LB8はPsudomonas属の細菌であると推定された．LB3は赤色調のコロニーを形成，LB8は黄緑色のコロニーを形成することから，それぞれShewanella属とPsudomonas属の特徴を示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画書記載の初年度目的は，藻食性魚類の網羅的探索および候補魚種を選定，腸内容物からDNA抽出後16SrDNA領域をターゲットとした次世代シーケンサーによる系統解析と組み合わせ，腸管内の微生物を網羅的に解析する．また，腸内微生物を培養し有用な海藻・珪藻分解微生物の単離を試み，菌種の同定および有用微生物の候補菌種の選定を連続的に行うことであるが，おおよそ計画通りに進行している．
藻食性魚類の腸内微生物叢の探索種にギンポ科3種を選定した．ヨダレカケは食性が藻類に限定，他の2種は雑食性であることから，腸内容物からのDNA解析では，ヨダレカケで得られた結果に較べ，イソギンポおよびカエルウオの菌種は少なかった．また，培養に関して，カエルウオは採集時期が限られていることから今回は行うことが出来なかった．従って，更なる候補魚種の選定とカエルウオの腸内容物の培養を試みる必要があると考える．
今回の研究手法の特徴として，ヨダレカケ腸内容物から直接的に菌種を単離して得られた株の16SrDNA領域を増幅してDNA配列を決定して菌種の同定を行う手法と，ヨダレカケ他2種の腸内微生物集団サンプルについては，16SrRNA領域を増幅したPCR産物からライブラリーを調製後，アンプリコンシーケンスを行い，16SrRNAデータベースに対して検索および系統解析を行う方法により，サンプル中に含まれる多様な細菌の特定や存在量，培養が困難であった細菌などのゲノム情報を得る手法の2方法を平行して行い比較したことである．本研究課題の目的である「腸内微生物叢から有用な海藻・珪藻分解微生物の探索手法の確立」であると考える．
社会貢献としては，研究初年度であることで，図書１であるが，2018年度は国際シンポにエントリーおよび国内学会において発表予定，現在論文執筆を行っている．
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| Strategy for Future Research Activity |
有効な藻食性魚類の更なる探索に加え，カエルウオのように採集時期が限られて，培養および消化管内容物の精査が行えなかった魚種の検討を行うとともに，最終的な目標であるアガロース，フコイダン，アルギン酸などの多糖類の分解速度の高い微生物探索のために，ヨダレカケやカエルウオを飼育し，フコイダンを高率に有するモズクを直接食させることで，腸内微生物の中からモズクを分解する微生物を効率的に抽出することを考えている．
DNA解析は，この度得られた95000～120000本の配列データから1,048本の代表的な菌種の配列と各サンプルにおける頻度をもとに，ヨダレカケでは，特異的に見られる細菌，特に既知のアガロース分解菌が見られないかについて継続して解析を行って，その全ゲノム解読を行っていく予定である．
培養では，得られたVibrio属の細菌（LB1, LB2, LB4, LB6株），Shewanella属（LB3），Psudomonas属（LB8）の細菌の生理学的，生化学的特徴を明らかにして，単離微生物株に含まれる酵素遺伝子の解析を行う予定である．最終的には，アガロース，フコイダン，アルギン酸などの多糖類の分解速度の高い微生物の存在を期待しており，分解酵素の性質の検討，その遺伝子の単離し，大腸菌内で酵素を大量に発現させて酵素の生産あるいは改変へと研究を進める予定である．
社会貢献としては，国際および国内学会において成果を発表，国際誌への投稿を予定している．またこの研究手法を広く公開する手段として，セミナーやマスコミ等への方向性を検討している．
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