2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18016002
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
三輪 佳宏 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 講師 (70263845)
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| Keywords | 蛍光タンパク質 / タンパク質分解 / イメージング / 遺伝子発現 |
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| Research Abstract |
本研究では、細胞内での分子間相互作用を定量的に解析するため、Tetデグラトン技術を総合的に応用することを目指した。
昨年度までに開発した新規Kaede変異体をユビキチン様タンパク質の網羅的な修飾依存的イメージングに応用した。その結果SUMOにおいて、核内と核膜上では異なる時間経過での相互作用が起こっていることを発見した。また他にも、特にNEDD8およびHUB1において、これまで報告のない特殊なイメージが得られた。
ドキシサイクリン検出プローブに用いていたEGFPを他の12種類の蛍光タンパク質に改変した一連のプローブを構築し、ドキシサイクリン濃度依存的な定量性、添加後の蛍光強度の上昇、除去後の蛍光強度の低下の時間経過などを詳細に解析した。その結果、それ自体が2量体化依存性の分解制御を受ける蛍光タンパク質に変更した場合には、EGFPおよびそのvariantsと比べて、バックグラウンドの蛍光が非常に低くなり、定量的な検出が容易であることが確認された。さらに、薬剤除去後の蛍光の消失速度も非常に早いこともわかった。一方で、薬剤添加後の蛍光の上昇に関しては、EGFPなどと比較してタイムラグが生じることが明らかとなった。
蛍光分子の細胞内局在を、フローサイトメーターを用いて定量的に解析できる実験法を確立し、特許出願した。とくに、流路の進行方向に補足レーザ=が絞り込まれている稀種を用いることによって、細胞質に蛍光が局在する細胞と、核に局在するものとを明確に分離することが可能であることが確認できた。
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