2007 Fiscal Year Annual Research Report
デグラトンプローブを用いたG蛋白質相互作用因子の解析
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18057003
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
三輪 佳宏 University of Tsukuba, 大学院・人間総合科学研究科, 講師 (70263845)
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| Keywords | 蛍光タンパク質 / タンパク質分解 / イメージング / 遺伝子発現 |
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| Research Abstract |
本研究では、タンパク質間相互作用の検出法の開発、およびそれを応用したGPCRの機能解析のための細胞内レベルコントロール方法として、Tetデグラトン技術を総合的に確立することを目指した。
前年度に引き続き、GPCR同士の分子集合を極めて効率良く高感度に検出する目的にデグラトンプローブを応用することを実施した。当初、ロイコトリエン受容体であるBLT1は初めからオリゴメリゼーションしているのに対して、BLT2はほとんど分子集合していないと予想していたが、さらに詳細な細胞内局在を解析してみると、話はそれほど単純ではなく、受容体タンパク質の不安定化も、蛍光強度の違いに影響していることを見いだした。また、GPCRの活性化の指標となるβ-arrestinとの相互作用は検出が難しかったが、β-arrestin自体のオリゴメリぜーションはある程度検出できる方法を構築することが必要である。
最後に、BRET法を用いた相互作用検出を改良し、相互作用の履歴をメモリーできるようにする実験手法を試みた。蛍光タンパク質の種類を変更することで、前年度に比べて高感度化することに成功したが、長時間の観察は困難であり、添加する試薬の種類や観察の光学系について何らかの工夫が必要であることが明らかとなった。これとは別にGPCRの活性化を細胞骨格のダイナミックな変化を指標にイメージングによって解析するあらたな手法を確立した。
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