2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18310132
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
林 哲也 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (10173014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 恵介 宮崎大学, 医学部, 助手 (10347057)
小椋 義俊 フロンティア科学実験総合センター, 助手 (40363585)
大岡 唯祐 宮崎大学, 医学部, 助手 (50363594)
桑原 知巳 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教授 (60263810)
黒川 顕 奈良先端科学技術大学院大学, 情報科学研究科, 助教授 (20343246)
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| Keywords | 遺伝学 / 腸内細菌叢 / ゲノム / メタゲノム / 難培養性 |
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| Research Abstract |
本研究の最終的な目的は、難培養性細菌が相当数を占める腸内常在細菌叢における腸管部位による細菌叢構成菌種の違いや特徴を明らかにすることである。このような特性を糞便のメタゲノム解析から明らかにすることは難しく、ヒトの場合には、倫理的・技術的な観点から、ほとんど不可能である。そこで、最も一般的な動物モデルであるマウスを材料として、宿主との相互作用という点では最も重要と考えられる粘膜表層、特に離乳期回腸粘膜表層の細菌叢にターゲットを絞り、その最優勢菌種であると予想される難培養性細菌Segmented filamentous bacterium(SFB)の全ゲノム解読に取り組んだ。
(1)マイクロマニピュレーターを用いたSFBの分離:離乳期の仔マウスから空腸・回腸部を採取し、マイクロマニピュレーターを用いて、約10,000個のSFBを回収してDNAを抽出した後、rolling circleamplification法で増幅を行い、ショットガンライブラリーを作成した。試験的なシークエンシングを行ったところ、プラスミド由来の配列が多数を占め、本法では全ゲノム解析に利用できるライブラリーの作成は難しいことが判明した。
(2)無菌マウスを用いたSFBの分離:SFBが芽胞形成細菌であり、クロロホルムに耐性であることが示唆されているため、離乳期の仔マウスから採取した空腸・回腸部をクロロホルム処理した後、無菌マウスに投与し、その空腸・回腸部を回収した。DNAを抽出し、16SrRNA配列を解析した結果、SFBのみが検出されたことから、本法によって、難培養性細菌であるSFBが分離できることが確認された。
(3)SFBのゲノム解析:抽出したDNAを用いてShort insert libraryを作成し、ランダムショットガンシークエンシングを行った。約20,000クローン分の画末端配列を決定したところ、SFB以外にXanthomonas由来配列が存在することが明らかとなった。しかし、GC含量から両者を区別できることが判明したため、SFB由来のATリッチな配列のみを用いてsuper-contigを作成し、現在フィニッシングが進行中である。
(4)ヒト由来SFB株の分離:無菌マウスを用いたSFBの分離法を用いて、乳児糞便由来のSFBの分離を行った。最初の試みは失敗に終わったが、サンプルの選択および調整法についての検討を進めており、工夫次第では、成功する可能性が高いと考えている。
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