ナイロンオリゴマー分解酵素の立体構造解析と人工アミド合成への応用

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18360400
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 根来 誠司 University of Hyogo, 大学院・工学研究科, 教授 (90156159)
• Keywords: ナイロンオリゴマー / Arthrobacter / X線結晶構造解析 / 6-アミノカプロン酸 / 6-Aminohexanoate oligomer / ナイロンオリゴマー分解酵素 / アミド合成 / 耐熱性酵素

Research Abstract

ナイロンオリゴマー分解酵系(NylABC)の触媒機構を実験・理論両面から解明すると共に、得られた知見を基盤として、バイオプロセス構築へ有用な酵素の構築を行った。まず、NylBと88%の相同性を有するカルボン酸エステル分解酵素(NylB')から、6-アミノヘキサン酸二量体加水分解活性の高機能化を行った。得られた変異酵素と基質との複合体の構造解析から、ナイロン基質のアミノ末端側を安定化するアミノ酸置換〔181位のグリシンからアスパラギン酸への置換(Gly181→Asp)、および266位のヒスチジンからアスパラギンへの置換(His266→Asn)〕と、カルボキシル末端側を安定化するアミノ酸置換〔370位のアスパラギン酸からチロシンへの置換(Asp370→Tyr)〕の2つの高機能化経路が存在することを明らかにした。さらに、これらの置換を租み合わせ、加水分解機能(K_<cat>/k_m)が、自然界から分離された酵素(NylB)より、約5倍上昇した変異酵素の構築に成功した。一方、90%tert-ブタノール/10%水の反応系では、加水分解の逆反応により効率的にアミド合成反応が進行するが、合成/分解活性比(初速度の比)、及び最終生成物濃度が上記の位置におけるアミノ酸置換で大きく変動するという興味深い現象を見いだした。この分子機構を構造レベルで明らかにするため、各種変異酵素とモノマー基質との複合体の立体構造解析を行った。その結果、アミド合成の高機能化には、基質により誘導されるオープン型からクローズ型への酵素の構造変化、特に触媒中心クレフト周辺の疎水環境場(水分子数・触媒部位の外部環境への遮蔽)の形成が重要であることが示された。また、食品添加物として有用なε-L-リシン誘導体(6-アミノヘキサン酸二量体アナログ)に対する活性が上昇した変異酵素の取得にも成功した。さらに、分子動力学法を用いたコンピュータシミュレーションから、D-リシンのαアミノ基による立体障害がDL識別の主要因であることを提案した。一方、物質生産過程では酵素の安定性が問題となるため、親型NylCの立体構造解析に基づき、タンパク質安定化に有望なアミノ酸置換を推定し、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異処理により、変異酵素を構築した。その中で、Asp36→Ala、Asp122→Gly、His130→Tyr、Glu263→Glnの4重変異を導入した酵素では、耐熱性が大幅に(熱変性曲線のTm値として36℃)上昇していることが分かった。変異酵素の構造解析から、熱安定性の上昇は、アミノ末端側から36番目、122番目付近の酸性アミノ酸残基同士の静電的反発の解消、130番目付近のアミノ酸残基によるループの安定化、263番目付近のループ領域の安定化に起因すると推定した。本研究の結果、産業応用への応用展開が期待できる酵素群を構築することができた。

Research Products

• [Journal Article] Enzymatic synthesis of nylon-6 units in organic solvents containing low concentrations of water (2010)
  • Author(s): Kawashima, Y., Yasuhira, K., Shibata, N., Matsuura Y., Tanaka, Y Taniguchi, M, Miyoshi, Y, Takeo, M Kato, D, Higuchi, Y, Negoro, S.
  • Journal Title: Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic 64 Pages: 81-88
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of the evolution of nylon-oligomer hydrolase, Ny1B (2010)
  • Author(s): Higuchi, Y, Shibata, N, Kawashima, Y, Ohki, T, Negoro, S.
  • Journal Title: Viva Origino (印刷中)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-ray crystallographic analysis of the 6-aminohexanoate cyclic dimer hydrolase : catalytic mechanism and evolution of an enzyme responsible for nylon-6 byproduct degradation (2010)
  • Author(s): Yasuhira, K, Shibata, N, Mongami, G Uedo, Y, Atsumi, Y, Kawashima, Y, Hibino, A, Tanaka, Y, Lee, Y-Ho, Kato, D, Takeo, M, Higuchi, Y, Negoro, S
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 285 Pages: 1239-1248
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Two alternative modes for optimizing nylon-6 byproduct hydrolytic activity from a carboxylesterase with b-lactamase fold : x-ray crystallo-graphic analysis of directly evolved 6-aminohexanoate-dimer hydrolase (2009)
  • Author(s): Ohki, T, Shibata, N, Higuchi, Y.Kawashima, Y, Takeo, M, Kato, D.Negoro, S.
  • Journal Title: Protein Science 18 Pages: 1662-1673
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular design of a nylon-6 byproduct-degrading enzyme from a carboxylesterase with a β-lactamase fold (2009)
  • Author(s): Kawashima, Y.Ohki, T.Shibata, N Higuchi, Y.Wakitani, Y.Matsuura, Y.Nakata, Y, Takeo, M, Kato, D, Negoro, S.
  • Journal Title: FEBS Journal 276 Pages: 2547-2556
  • Peer Reviewed
• [Presentation] エコ・ナノ・バイオ境界領域の開拓を目指して (2009)
  • Author(s): 根来誠司
  • Organizer: 日本材料学会 UFA研究分科会 第10回講演会
  • Place of Presentation: 大阪大学
  • Year and Date: 2009-12-08
• [Presentation] 加水分解酵素の逆反応によるアミド合成:高効率触媒の形成要件 (2009)
  • Author(s): 河島康之, 松浦悠介, 柴田直樹, 田中優佑, 小林達也, 武尾正弘, 加藤太一郎, 樋口芳樹, 根来誠司
  • Organizer: 日本生物工学会 第61回大会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2009-09-24
• [Presentation] N-terminal nucleophile(Ntn)hydrolase superfamily(Ny1C)の耐熱化機構 (2009)
  • Author(s): 柴田浩, 田中優佑, 橋本悠, 松浦悠介, 柴田直樹, 李映昊, 櫻井一正, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 後藤祐児, 根来誠司
  • Organizer: 日本生物工学会 第61回大会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2009-09-24
• [Presentation] 6-アミノヘキサン酸環状2量体加水分解酵素(Ny1A)の触媒機構 (2009)
  • Author(s): 安平健吾, 柴田直樹, 門上剛, 厚海悠, 日比野敦, 吉野拓真, 河島康之, 加藤太一郎, 武尾正弘, 樋口芳樹, 根来誠司
  • Organizer: 日本生物工学会 第61回大会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2009-09-24
• [Presentation] ナイロンオリゴマー分解酵素(Ny1C)の安定性と触媒機能に及ぼすアミノ酸置換効果 (2009)
  • Author(s): 柴田浩, 熊谷尚也, 松浦悠介, 田中優佑, 橋本悠, 加藤太一郎, 柴田直樹, 武尾正弘, 樋口芳樹, 根来誠司
  • Organizer: 日本生物工学会 第61回大会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2009-09-24