2008 Fiscal Year Annual Research Report
出芽酵母26Sプロテアソームの形成と機能に関する時空制御
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18370002
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
東江 昭夫 Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90029249)
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| Keywords | 26Sプロテアソーム / パン酵母 / マス解析 / 黒カビ / 高温生育性 / 蛍光タイフーン |
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| Research Abstract |
26Sプロテアソームは分子量約2MDaの巨大な蛋白質複合体である。66余の基本的的なサブユニットの組成は明らかにされている。これまでわれわれは26Sプロテアソームの精製法を開発し、ユビキチン化基質の合成法の開発にも成功した。しかし、サブユニット組成は明らかになったが、詳細な構造については不明である。今年度は以下の実験を行った。(1)カビの26Sプロテアソームのサブユニッット構成を酵母のものと比較した。(2)フルオレッセンスタイフーンによって26Sプロテアソーム中間体を検出する方法を検討した。(3)リッド形成の中間体を大腸菌内で作ることを試みた。
(1)高温で生育するカビの26Sプロテアソームのサブユニットをアフィニティー精製後マス解析したととろ、基本的なサブユニットは全て同定できた。しかし、数回の試行でSemlが出されなかったので、Semlの存在を検討するため、SemA(カビのSemlホモログ)のC-末に3xFLAGタグをつけ、カビで発現させた。そのカビから26Sプロテアソームを3xFLAG抗体により26Sプロテアソームを精製することができたので、SemAが26Sプロテアソームに結合していることが確かめられた。後に、マス解析でも同定できた。
(2)ベースのサブユニットとリッドのサブユニットをそれぞれRFPとGFPでタグし、粗抽出液を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、タイフーンで蛍光を、蛍光基質をもちいてペプチダーゼ活性を検出する実験系を構築した。これによりプロテアソームのサブユニットを含み、移動度の高い複合体を検出できる。ゲルからバンドを切り取り、マス解析した結果、一部のサブユニットを含む複合体であることが分かった。温度感受性の変異と組み合わせることにより、特定の変異によってどこまでサブユニットの集合が進むかを明らかにすることが可能である。
(3)リッドの中核となるサブユニットはRpn5,8,9,11であることが分かっている。これらのサブユニット遺伝子を大腸菌内で同時に発現させることにより、複合体ができるかを検討した。Rpn8とRpn11は大腸菌内で複合体を形成間した。
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[Journal Article] Lysine 63-linked polyubiquitin chain serves as a targeting signal for the 26S proteasome2009
Author(s)
Saeki, Y., Kudo, T., Sone, T., Yokosawa, H., Toh-e, A., Tanaka, K.
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Journal Title
Peer Reviewed
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[Presentation] Lysine 63-linked polyubiquitin chain serves a targeting signal for the 26S proteasome2008
Author(s)
Sseki, Y., Yokosawa, H., Toh-e, A., Tanaka, K
Organizer
The 5^<th> International Symposium on the COP9 signalosome, PRoteasome, and eIF3 : At the interface between signal and proteolysis
Place of Presentation
RIKEN Yokohama, Japan
Year and Date
20081111-20081114
