新規なpH温度ジャンプトリガーを利用したNdxファミリー酵素の4次元構造解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18370047
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 神谷 信夫 大阪市立大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60152865)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮原 郁子 大阪市立大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (40271176) ; 中川 紀子 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (50379278) ; 倉光 成紀 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (60153368)
• Keywords: 4次元構造解析 / pHジャンプ / 温度ジャンプ / Ndxファミリー / 機能ゲノム

Research Abstract

生命化学反応では一般に複数の反応素過程が連続して起こる。本研究では、4次元結晶構造解析法により、時間軸に沿って変化するNdxファミリー酵素の反応中心の立体構造を高分解能のスナップショットとして決定し、それぞれを初期構造として分子動力学的に各反応素過程をシミュレーションして、さらにそれらを繋ぎ合わせて反応の全体像を理解する新しい手法の開発を目指している。本研究は、(1)Ndx4基質複合体の高分解能結晶の準備、(2)pHジャンプの条件設定、(3)ガラス転位点におけるアニーリング、(4)温度ジャンプと反応開始の確認、(5)SPring-8における4次元構造解析用データ収集、(6)スナップショットの構造解析と反応機構モデルの実証、の6段階からなる。本年度は、(1)にっいては、Ndx4基質複合体結晶の分解能を1.5Åまで拡大することに成功した。(2)については種々の条件を試した結果、Ndx4基質複合体の結晶に対してpHジャンプを行い、反応直前の段階に構造を固定することに成功した。またその結晶構造解析を行って、反応直前の初期構造と反応終了段階の構造を決定した。(3)については、窒素ガス吹付け低温装置を購入してクライオ試料保存装置を製作した。完成した装置を利用して、ガラス転位の確認とアニーリングの可能性について検討した。また(6)に関連してNdx4基質複合体の分子動力学計算の準備を進めた。

Research Products

• [Journal Article] Mutational study on aGln90 of Fe-type nitrile hydratase from Rgidiciccys so. N771 (2006)
  • Author(s): Takarada, H., Kawano, Y., Hashimoto, K., Nakayama, H., Ueda, S., Yohda, M., Kamiya, N., Dohnae, N., Maeda, M., Odaka, M.
  • Journal Title: Biosci. Biotech. ＆ Biochem. 70 Pages: 881-889
• [Journal Article] Kinetic and Structural Studies on the Catalytic Role of the Aspartic Acid Residue Conserved in Copper Amine Oxidase (2006)
  • Author(s): Chiu, Y-C., Okajima, T., Murakawa, T., Kamiya, N., Kuroda, S., Hayashi, H., Yamamoto, Y., Tanizawa, K.
  • Journal Title: Biochemistry 45 Pages: 4105-4120
• [Journal Article] Mutational Designing of the Active-Site Architecture of Porcine Kidney D-Amino Acid Oxidase toward Novel Function : Directed Evolution of the "Active-Site Lid" for Substrate Specificity (2006)
  • Author(s): Setoyama, S., Nishina, Y., Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Kamiya, N., Shiga, K., Miura, R.
  • Journal Title: J. Biochem. 139 Pages: 873-879