2007 Fiscal Year Annual Research Report
窒素含有キラル化合物不斉合成のための微生物生産プロセスの開発
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18380057
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
片岡 道彦 Kyoto University, 農学研究科, 准教授 (90252494)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
小川 順 京都大学, 農学研究科, 助教 (70281102)
櫻谷 英治 京都大学, 農学研究科, 助教 (10362427)
萩下 大郎 京都大学, 農学研究科, 准教授 (20432346)
日比 慎 京都大学, 農学研究科, 助教 (30432347)
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| Keywords | キラル化合物 / カルボニル還元酵素 / バイオ不斉還元 / アミノアルコール脱水素酵素 / ランダム変異 / Agrobacterium / Rhodococcus / Hansenula |
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| Research Abstract |
本研究は、いくつかの窒素含有キラル化合物の生産に有用なカルボニル還元酵素のタンパク質科学・遺伝子工学の面からの解析を行い、これをバイオ不斉還元システムに応用した効率的な生産プロセスの開発を成し遂げようとするものである。(1)Agrobacterium tumefaciensから取得した3-キヌクリジノン還元酵素をコードする遺伝子のクローニングを行い、大腸菌内で大量発現させることに成功した。さらに、還元反応に必要な補酵素NADHを供給する系としてグルコース脱水素酵素遺伝子を、同じ大腸菌内に共発現させた。この共発現菌体を触媒として、3-キヌクリジノンの不斉還元反応を行ったところ、20%基質を定量的に変換して(R)-3-キヌクリジノールを生産することに成功した。(2)Rhodococcus erythropolisのアミノアルコール脱水素酵素によるアミノケトン化合物不斉還元反応における生成物阻害を解除するため、本酵素遺伝子のランダム変異を行い安定性の優れた変異型酵素を取得した。これらの変異酵素を解析した結果、5カ所アミノ酸残基に置換変位が導入されていることが判明した。(3)スクリーニングで見出した(S)-アミノケトン還元酵素活性を有する酵母Hansenula ofunaensis等3株から、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明を行った。(4)上記でクローニング・ライブラリー化した酵素に加えて、探索により発見した菌株からの酵素・遺伝子の単離を進め、酵素ライブラリーの充実を図った。
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