2007 Fiscal Year Annual Research Report

膜タンパク質機能構造の効率的解析を目的とする動的光アフィニティー技術の開発

Research Project

Project/Area Number	18390036
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	友廣岳則 University of Toyama, 大学院・医学薬学研究部, 准教授 (70357581)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	畑中保丸富山大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (30111181) 水口峰之富山大学, 大学院・医学薬学研究部, 准教授 (30332662)
Keywords	光アフィニティーラベル / ジアジリン / 膜受容体 / 固相スクリーニング / リガンド結合解析
Research Abstract	膜タンパク質同定やその結合部位解析における煩雑な操作過程を簡便化する光ラベル技術開発を目的とする。本研究では、光クロスリンカーの機能化による効率化と固相光アフィニティーキャプチャー法を利用したハンドリングや精製の効率化が必須である。前年度に作成したチオリン酸エステル型の核酸(GTP,ATP)プローブは、コンパクトな構造ながらも光反応基、精製基、切断基が組み込まれた多機能型である。このATPプローブを用いて光アフィニティーラベルを基盤技術としてプロテオミクス的効率解析を達成し、一方ではリン酸化によるミオシンモーターの動的挙動に関連して、光クロスリンク/Fe-IMACを利用した結合タンパク質解析によりミオシンのその結合様式に関して新知見が得られた。一方、結合タンパク質同定やラベル部位解析においては、シグナル伝達に関与する核酸結合性膜タンパク質を標的として、そのP-S切断を利用した結合部位精製系の構築を目指した。この系ではタンパク質のリガンド結合部位に新たなSH基を導入できるため、結合部位の精製において、このSH基をターゲットにしてそれを含有するフラグメントを選択的に回収することが可能である。金属キレートによるタンパク質、ペプチド回収は選択性が高く有用であるため、本年度は独自の固相系にキレート配位子を導入した表面構築を行った。まず、モデルペプチドを用いて精製系の評価を行ったところ、フェムトモルレベルで検出システム構築を達成した。しかしながら、極微量の結合部位(ラベルペプチド)の単離・取得という目的には、サンプルの移し替えなどハンドリングするステップ数に従いロスが大きく、しかもラベルペプチドの物性による影響が大きく、この精製システムでは目的の物質量を取り扱うことは困難であることが判明した。そこで、ラベル化から精製まで同一固相上で行うことが可能な新たなシステム構築に着手した。