2006 Fiscal Year Annual Research Report
環境中アレルゲンの一次構造並びに高次構造を認識する高感度エピトープ解析手法の開発
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18390043
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
手島 玲子 国立医薬品食品衛生研究所, 機能生化学部, 室長 (50132882)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
美宅 成樹 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (10107542)
中村 亮介 国立医薬品食品衛生研究所, 機能生化学部, 主任研究官 (50333357)
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| Keywords | アレルゲン / ソバ / ファージディスプレイ / エピトープ / ミモトープ / バイオインフォマティクス / ジスルフィド結合 |
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| Research Abstract |
(1)ファージディスプレイ法を用いる立体構造を含むエピトープを解析する手法の開発…そば主要アレルゲンであるペプシン耐性を有する16-kDaタンパク質のcDNAを大腸菌に組込み、組換えタンパクの発現、精製を行った。ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを提示しているM13ファージライブラリーを用いて、16kDaタンパクのエピトープ様の配列(ミモトープ)を同定し、ペプチドの段階的重複鎖(overlapping peptide)を固定した(spot)膜を用いて得られた一次構造エピトープ配列との比較を行った。
(2)野生型組換えアレルゲンタンパク質及びその変異体の大腸菌での作製…アレルゲンの立体エピトープの形成に関与すると思われるシステイン残基の変異体を作成し、そばアレルギー患者IgE抗体との反応性を検討し、システイン残基の立体エピトープへの関与の有無を検討し、特定の位置のシステイン残基による分子内ジスルフィド結合が、IgE抗体との結合活性、ペプシン分解性に大きく影響を与えることが判明した。
(3)アレルゲンのエピトープ付近に特徴的なアミノ酸配列の物理化学的因子の特徴の解明…バイオインフォマティクス手法による既知のアレルゲンに特徴的なアレルゲンユニーク断片(AUF)のインデックスを用いたアレルゲンエピトープ予測法の検討を開始した。AUFインデックスのプロットのピークは、二次構造の端に近いところに存在していることが確認された。
(4)そば以外のアレルゲンの主要アレルゲンの解析…これから、遺伝子改変体の開発が予想されるさけの主要アレルゲンの解析を行った。手法としては、二次元電気泳動にて試料中のタンパク質の分離を行い、アレルギー患者血清中のIgE抗体が認識するタンパク質をウェスタンブロット法で解析した。コラーゲン、パルブアルブミンに加え、GAPDHもアレルゲンの候補として考えられた。
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