血管内皮細胞カルシウム流入経路関連遺伝子の網羅的解析と創薬ターゲット遺伝子の探索

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18390074
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 渡邉 裕司 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50262803)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 洋 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (30293632) ; 加藤 秀樹 浜松医科大学, 医学部, 助手 (80314029) ; 最上 秀夫 浜松医科大学, 医学部, 助教授 (90311604)
• Keywords: 循環 / 血管内皮細胞 / カルシウム / ゲノム / 創薬

Research Abstract

血管トーヌスや透過性調節など多くの内皮機能の発現・調節に細胞内カルシウムイオン(Ca^<2+>)濃度の変化が関与し、とくに細胞外からの容量性Ca^<2+>流入が重要であることが注目されている。
本研究では、血管内皮細胞における容量性Ca^<2+>流入経路に関連する遺伝子群を網羅的に解析し、創薬ターゲットとなる候補遺伝子を探索することを目的とする。
平成18年度研究では、以下の研究方法に従い、DNAマイクロビーズアレイ技術を用い容量性Ca^<2+>流入を保持した培養血管内皮細胞系と、容量性Ca^<2+>流入が失活した細胞系とで発現量が変化する遺伝子群を網羅的に取得し、得られたcDNAをPCR増幅、クローニングした後に、それぞれの遺伝子配列を決定した。
1)対象:ブタ下行大動脈血管内皮細胞から分離樹立した容量性Ca^<2+>流入が失活した培養血管内皮細胞系(D系)と、容量性Ca^<2+>流入を保持した細胞系(W系)を対象とした。
2)D系と、W系とで、mRNAを抽出し、PCR-Select cDNAサブトラクション法を用い、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが生じているcDNAからアレイによるスクリーニングを行い差次的発現遺伝子を単離した。
3)ドットプロット法によるディファレンシャルスクリーニングとバーチャルノーザンブロット法によりcDNA発現量の差を確認後、cDNAのシークエンシングを実施し既知遺伝子およびESTの配列と比較し、クローンを同定した。
4)クローニング用のベクターはpT7Blue-2のBam HI/Eco RI間にPac Iサイトを導入したものを使用し、回収したBam HI-Pac I断片をpT7Blue-2のBam HI-Pac I間にライゲーションした。T7プライマーを用いてDye Terminator法によりシーケンス反応を行い、キャピラリーシーケンサーにてワンパスDNAシーケンシングを行った。