肝細胞移植療法の確立をめざしたヒトES細胞から肝細胞への分化誘導法の開発

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18390365
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 猪飼 伊和夫 京都大学, 医学研究科, 助教授 (60263084)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中辻 憲夫 京都大学, 再生医科学研究科, 教授 (80237312) ; 安近 健太郎 京都大学, 医学研究科, 助手 (00378895) ; 波多野 悦郎 京都大学, 医学研究科, 助手 (80359801)
• Keywords: 細胞移植 / ヒトES細胞 / 肝細胞 / 肝臓外科学

Research Abstract

1.遺伝子改変ヒトES細胞株の作製
1)遺伝子改変用プラスミドベクターの作製
ヒトES細胞のgenomic DNAからlong-PCR法を利用してalpha-fetoprotein (AFP)のenhancer及びpromoter領域をクローニングし,これらからenhancer/promoterのhybrid promoterを作製した.このhybrid promoterをenhanced green fluorescent protein (EGFP)遺伝子の上流に組み込み,AFP転写領域下にEGFP遺伝子を発現するプラスミドベクターを作製した.
2)ヒトES細胞へと遺伝子導入及び遺伝子改変細胞株の獲得
上記プラスミドベクターをlipofection法にて,ヒトES細胞株(KhES1,KhES2,KhES3)に遺伝子導入し,ネオマイシンによる薬剤選別により安定導入株を得ることが出来た.
2.ヒトES細胞由来内胚葉系細胞の単離
1)ヒトES細胞の分化誘導
上記で作製した安定導入株を,a) embryoid bodyを作成する方法,b) stromal cell lineと共培養する方法,c) hepatocyte growth factorやbasic fibroblast growth factor等の液性因子を添加する方法で分化誘導を行った.分化したヒトES細胞に対して免疫染色を行い,AFPとEGFPとが同一の細胞で発現している遺伝子導入細胞株が,KhESlで1株,KhES3で2株得られた.これらの細胞株を分化誘導し蛍光励起セルソーターで解析したところEGFP陽性率は5〜15%程度であった.
2)内胚葉系細胞の単離と特性解析
セルソーターにてEGFP陽性細胞を単離・培養することが出来た.単離したヒトES細胞由来EGFP陽性細胞は全てAFPを発現していた.