2008 Fiscal Year Annual Research Report
骨特異的新規分泌タンパクHA4の基礎研究および臨床応用
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18390413
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
秋山 治彦 Kyoto University, 医学研究科, 准教授 (60402830)
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| Keywords | HA / 新規分泌蛋白質 / 骨特異的 / ノックアウトマウス / トランスジェニックマウス |
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| Research Abstract |
HA4 recombinantタンパク質を用いてマウスを免疫し脾臓を取り出し、脾細胞とミエローマ細胞を細胞融合させハイブリドーマを作製し、HAT選択を施行した。20個のハイブリドーマの抗体産生能をその培養上清を採取しELISAで確認した後、ウエスタンブロット解析でrecombinantタンパクを検出できるかどうかでスクリーニングし、高い抗体産生能を認めた5個のハイブリドーマを限界希釈法でクローニングし、それぞれの抗体産生能を同様にウエスタンブロット法で確認した。
5種類のモノクローナル抗体より2個ずつを選び、HA4 recombinantタンパク質を用いてサンドイッチELISAの予備実験を行った。一方の抗体をビオチン標識したのちサンドイッチELISAを行ったが、どの組み合わせにおいてもHA4 recombinantタンパク質の特異的検出感度が低く、実用に耐えるものではなかったため、市販のHA4(Cthrc 1と同一のタンパク質であった)ポリクローナル抗体とビオチン標識モノクローナル抗体を用いてサンドイッチELISAを施行したところ、ng/mlオーダーの検出感度でHA4タンパク質を検出する事が可能であった。現在、野生型マウス、HA4ノックアウトマウス(ネガティブコントロールとして)およびHA4トランスジェニックマウスの血清を採取し、血清中のHA4濃度を測定するための予備実験を実施しているところである。
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