2008 Fiscal Year Annual Research Report
角膜疾患に対する遺伝子導入・細胞移植・再生医学による総合的治療
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18390473
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| Research Institution | National Research Institute for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
東 範行 National Research Institute for Child Health and Development, 病院第二専門診療部眼科, 医長 (10159395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仁科 幸子 国立成育医療センター(研究所), 病院第二専門診療部眼科, 医師 (40237954)
横井 匡 国立成育医療センター(研究所), 病院第二専門診療部眼科, 医師 (80514025)
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| Keywords | 再生医学 / 遺伝学 / 角膜 |
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| Research Abstract |
角膜内皮細胞は一旦障害され細胞死に至ると、通常再生されず、障害を受けた細胞周囲の細胞がその機能を補う。内皮細胞障害が広範囲に及べば、角膜は混濁し視力が低下する。これまで、治療には角膜移植を必要とし、角膜移植合併症や、患者負担が大きい点などが問題であった。従って、薬物治療などによる内皮機能温存の研究や、角膜内皮機能の更なる解明のためには、ヒト角膜内皮細胞株の樹立が必須であった。今回、我々は、小児の摘出眼球から角膜内皮を単離、培養し、以下のとおり株化に成功した。
片眼の網膜芽細胞腫に罹患し、患眼の摘出に至った3歳児の摘出眼球を、インフォームドコンセントを得て研究試料とした。眼球の角膜内皮を顕微鏡下で単離し培養した。初代培養細胞にレトロウイルスベクターを用いて不死化遺伝子HPV16 E6E7、hTERT、cdk4、cyclinD1を、単独あるいは種々の組み合わせで導入し、全10種類の遺伝子導入細胞をクローンニングした。全10種類(#1〜#10)の遺伝子導入細胞における導入遺伝子の発現を、Western blot法で解析した。各遺伝子の蛋白発現は下記の如くであった。#1 cdk4/cyclinD1、#2 cdk4/cyclinD1/hTERT、#3 cdk4 #4 cdk4/hTERT、#5 cdk4/cyclinD1、#6 cdk4/cyclinD1、#7 cdk4/cyclinD1/hTERT、#8 HPV16 E6E7、#9 HPV16 E6E7/hTERT、#10 hTERT。このうち、#4、#5、#6は、世代を経ても分裂速度に変化がなく不死化した。全10種類の遺伝子導入細胞で、蛍光抗体免疫染色によりZo-1、Na-k ATPaseの蛋白発現が、RT-PCR法によりNa-k ATP ase、keratinl2、vdac3、clcn3、slc4a mRNAの発現が確認された。遺伝子導入細胞のポンプ機能はUssing chamberを用いて評価した。ウアバイン0.1mMを添加し、電位差を確認した。平均電位差は、2.0mVであった。以上の特微から、樹立した細胞株は角膜内皮の特性を備えていることが確認できた。
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[Journal Article] Pax6-5a promotes neuronal differentiation of murine embryonic stem cells2009
Author(s)
Shimizu N, Watanabe H, Kubota J, Wu J, Saito R, Yokoi T, Era T, Iwatsubo T, Watanabe T, Nishina S, Azuma N, Katada T, Nishina H.
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Journal Title
Biol Pharm Bull (In press)
Peer Reviewed
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