2007 Fiscal Year Annual Research Report
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18500374
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
小川 良平 University of Toyama, 大学院・医学薬学研究部, 講師 (60334736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
近藤 隆 富山大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (40143937)
趙 慶利 富山大学, 大学院・医学薬学研究部, 助教 (90313593)
李 成一 関西医科大学, 生命医科学研究所, 准教授 (90361964)
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| Keywords | プロモーター / シスエレメント / TATAボックス / 変異導入型PCR / 超音波 |
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| Research Abstract |
昨年度構築した超音波照射により約6倍活性が増強するロモーターでルシフェラーゼ遺伝子を発現する遺伝子カセットを安定に導入したHeLa細胞を構築した。これをヌードマウスの両背部に移植し、直径が約0.5cmとなったところで超音波照射を行いin vivoでのプロモーターの反応性を調べた。In vitroと同じ条件(1MHz、1W/cm^2、Duty Factor (DF) 10%、60秒間照射)で片側の腫瘍のみを照射したが、ルシフェラーゼの増強は認められなかった。そこで、より強い照射(1MHz、2W/cm^2、DF 10%、120秒間照射)を行ったところ、何匹かのマウスで反応が見られたが、平均では超音波に反応しないSV40プロモーターの値と統計的な差は認められなかった。さらに反応性の高いプロモーターを構築するため昨年度構築したプロモーターと同様の方法で新たに超音波応答性プロモーターの構築を行った。4種類のシスエレメントをランダムに組み合わせて構築した61プロモーターの反応性を調べ、昨年取得したプロモーターよりも高い反応性を示すものを7種類見いだした。そのうち特に活性が強いクロン31について調べた。遺伝子導入細胞に照射したところ、ルシフェラーゼ活性は照射後6時間でピークに達し、また、0.5W/cm^2で、また、120-180秒の照射でピークに達した。ピーク後に再度照射しても再び活性化することから、複数回の発現制御が期待できる。また、抗酸化剤の添加で超音波による活性化が抑制されるため、活性化は酸化ストレスを介していると考えられた。塩基配列分析の結果、ほとんどのシスエレメントがNF-κBであることが判明した。今後は、変異導入型PCRにより改良を行い、超音波による治療遺伝子発現制御が可能な組み換えウイルスベクターの作成を行う。
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