核内高次構造を介する転写制御機構解明に向けた人工染色体操作技術の活用

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18510174
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 井上 敏昭 鳥取大学, 医学部, 助教授 (80305573)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 基伸 鳥取大学, 医学部, 助手 (00273904) ; 松田 賢一 京都府立医科大学, 大学院・医学研究科, 講師 (40315932)
• Keywords: 人工染色体 / 核内高次構造 / 可視化 / 転写調節 / 染色体テリトリー

Research Abstract

我々は、核の高次構造の体系的解析を進めるための新たな技術としてゲノムを自由に扱い生細胞内での挙動を可視化するゲノム操作技術を開発した。これはBACでのゲノム改変技術、さらにBACを搭載できるベクターである人工染色体の操作技術を利用する技術である。本研究では、HACに搭載したヒトHoxB遺伝子クラスターを例として以下の三点について明らかにし、本技術が核内高次構造を介する転写制御機構解明に有用であることを示す。1.核内高次構造を介した転写調節の可視化、2.核内高次構造を介する転写制御に必要なゲノム領域の同定、3.核内高次構造を介する転写制御を行う候補タンパク質の同定と生細胞での動態観察を目指した。
今年度は目的とするHoxB遺伝子クラスターを含むBACを取得した。人工染色体ベクターに搭載する上で必要なLoxP+選択マーカー遺伝子をタグするゲノム改変を試みたところ、この改変のための宿主大腸菌内ではHox遺伝子クラスターを含むBACは不安定でゲノムの再編成がおきてしまい、これを回避することは困難であった。そこで方針を変え、HoxB遺伝子クラスターのマップされるヒト当該染色体を導入することにした。
マウスES細胞についてHoxBの核内高次構造変化を伴う発現誘導を観察するため、神経分化誘導したところたしかに分化誘導はおこるものの、その同調性に問題があることが判明した。そこでマウスES細胞が偶発的な分化状態にあるときには死滅するような(未分化マーカーが発現しているときのみ生存できるような)選択マーカー遺伝子を挿入したマウスES細胞を選択している。このようなマウスES細胞が取得できしだい、ヒト当該染色体を移入し、神経分化誘導に伴う変化を確認し、発現に重要であると推測される部位を改変したものについても同様の解析を行うこととする。