2006 Fiscal Year Annual Research Report
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18550162
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Research Institute for Biological Science Okayama |
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Principal Investigator |
畑中 唯史 岡山県生物科学総合研究所, 研究員 (00344408)
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| Keywords | 蛋白質 / バイオテクノロジー / アミノペプチダーゼ / 放線菌 |
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| Research Abstract |
異なる耐塩性を示す、放線菌由来の2種のプロリンアミノペプチダーゼ(PAP)を材料に、大腸菌によるin vivo DNA shuffling(Repeat-length Independent Broad Spectrum[RIBS] shuffling)を行い、異なる切り替えポイントをもつ8種のキメラ遺伝子を作成した。これらを、大腸菌(JM109)およびコールドショックベクターにより発現させ、NaClの活性・CDスペクトル・疎水性プローブ結合・4次構造に対する影響を検討した。その結果、PAPの耐塩性は、N末端付近に重要な部分があることが示唆された。また、これらキメラ酵素のプロリン誘導隊に対するキネティクス解析により、基質認識、触媒効率にもN末端部分は関与していることも明らかにした(論文投稿中)。
PAPの大腸菌での発現量が低いため、接合伝達を利用し、放線菌(Streptomyces lividans)を宿主とした新たな発現系を構築した。この発現系を用いて、PAPを発現させた場合、分泌シグナルをもたないにもかかわらず、菌体外に活性型PAPは分泌されることを見出した(特許出願および論文準備中)。
また、アミノ酸リガーゼ創製に向けて、PAPの活性中心であるセリン残基をシステインに置換した変異酵素の作成を試みたが、大腸菌および放線菌のいずれを宿主とした場合においても、活性体を得ることはできなかった。
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