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2007 Fiscal Year Final Research Report Summary

細菌によるグルタチオン直接発酵法の開発とグルタチオン代謝系に関する基礎研究

Research Project

Project/Area Number 18580074
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Research Field Applied microbiology
Research InstitutionKyoto Institute of Technology (2007)
Kyoto University (2006)

Principal Investigator

鈴木 秀之  Kyoto Institute of Technology, 工芸科学研究科, 教授 (10202136)

Project Period (FY) 2006 – 2007
Keywordsグルタチオン / 結晶構造解析 / γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / 大腸菌 / γ-グルタミルシステイン合成酵素
Research Abstract

すべての生物を通して初めてγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)の結晶構造解析に成功した。また、γ-グルタミル酵素中間体の構造も明らかになり、基質認識に関わるアミノ酸残基を特定した。この結果に基づいて部位特異的変異を加え、GGT変異酵素のグルタリル-7-アミノセファロスポラン酸アシラーゼ活性を50倍に増強することに成功した。GGTの古典的な阻害剤であるアザセリンやアシビシンとの共結晶の3次元構造を決定した結果、これまで提唱されていた阻害メカニズムでは説明できないことが明らかとなり、新しい阻害メカニズムを提唱した。一方、自己触媒的プロセシング前の前駆体型GGTの結晶構造解析を行い、プロセシング反応の求核残基もThr391の側鎖のO原子であることを示した。プロセシングによって活性中心の付近の構造変化により活性中心が形成されることが明らかとなった。
以前から得られていたγ-グルタミルシステイン合成酵素(GshA)の脱感作変異株は3カ所に変異(W100L,A494G,S495F)があったが、そのうちS495Fが脱感作に寄与していることを明らかにし、40mMグルタチオン共存下においてもほとんど活性に影響を受けないことを示した。また、gshA履遺伝子のイニシエーションコドンをTTGからATGに変え、翻訳が起こりやすくした。さらに、GshAの表面に局在しタンパク質を不安定化させる4つのCys残基をSerに置き換え、酵素の安定化を図った。さらに、セリンアセチルトランスフェラーゼにM256I変異を導入してCysに対して脱感作した。培養条件、特にC源S源について検討を加えた。以上の改良点を総合することにより、大腸菌の培養液上澄中に約1mMのグルタチオンを蓄積させることに成功した。

  • Research Products

    (14 results)

All 2008 2007 2006

All Journal Article (8 results) (of which Peer Reviewed: 8 results) Presentation (6 results)

  • [Journal Article] Improvement of the glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity of a bacterial γ-glutamyltranspeptidase.2008

    • Author(s)
      Chiaki. Yamada
    • Journal Title

      Applied and Environmental Microbiology 74

      Pages: 3400-3409

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structures of Escherichia coli γ-glutamyltranspeptidase in complexwith azaserine and acivicin: Covalently bound inhibitors with the catalytic Thr391 in a novel manner and mechanistic implication for inhibition by glutamine antagonists.2008

    • Author(s)
      Kei Wada
    • Journal Title

      Journal of Molecular Biology (In press)

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Autoprocessing of H. pylori γ-glutamyltranspeptidase leads to the formation of a threonine-threonine catalytic dyad.2007

    • Author(s)
      Gina Boanca
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry 282

      Pages: 534-541

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structure of the γ-glutamyltranspeptidase precursor protein from Escherichia coli: Structural changes upon autocatalytic processing and implications for the maturation mechanism.2007

    • Author(s)
      Toshihiro Okada
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry 282

      Pages: 2433-2439

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] γ-Glutamyl compounds and their enzymatic production using bacterial γ-glutamyltranspeptidase.2007

    • Author(s)
      Hideyuki Suzuki
    • Journal Title

      Amino Acids 32

      Pages: 333-340

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Improving the umami taste of soy sauce by the addition of bacterial γ-glutamyltranspeptidase as a glutaminase to the fermentation mixture.2007

    • Author(s)
      Kyoko Kijima
    • Journal Title

      Enzyme and Micobial Technology 41

      Pages: 80-84

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structures of γ-glutamyltranspeptidase from E. coli a key enzyme in glutathione metabolism, and its reaction intermediate.2006

    • Author(s)
      Toshihiro Okada
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences USA 103

      Pages: 6471-6476

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] γ-(Monophenyl)phosphono glutamate analogues as mechanism-based inhibitors of γ-glutamyl transpeptidase.2006

    • Author(s)
      Liyou Han
    • Journal Title

      Bioorganic and Medical Chemistry 14

      Pages: 6043-6054

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Improvement of the Umami taste in soy sauce by the addition of bacterial γ-glutamyltranspeptidase to the fermentation mixture.2007

    • Author(s)
      Kyoko Kijima
    • Organizer
      8th Wartburg Symposium on Flavor Chemistry and Biology
    • Place of Presentation
      Eisenach, Germany
    • Year and Date
      20070302-03
  • [Presentation] γ-グルタミルトランスペプチダーゼのGL-7-ACA活性の上昇.2007

    • Author(s)
      山田千晶
    • Organizer
      平成19年度日本生化学会・日本分子生物学会合同大会
    • Place of Presentation
      横浜、パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2007-12-13
  • [Presentation] γ-グルタミルトランスペプチダーゼのGL-7-ACAアシラーゼ活性上昇に関する研究.2007

    • Author(s)
      山田千晶
    • Organizer
      平成20年度日本農芸化学会大会
    • Place of Presentation
      名古屋、名城大学
    • Year and Date
      2007-03-27
  • [Presentation] Improvement of the flavor of amino acids and peptides using bacterial γ-glutamyltranspeptidase.2007

    • Author(s)
      Hideyuki Suzuki
    • Organizer
      8th Wartburg Symposium on Flavor Chemistry and Biology
    • Place of Presentation
      Eisenach, Germany
    • Year and Date
      2007-03-02
  • [Presentation] 結晶構造に基づくγ-グルタミルトランスペプチダーゼの酵素反応および成熟化機構.2006

    • Author(s)
      岡田敏洋
    • Organizer
      第3回生体分子科学討論会
    • Place of Presentation
      名古屋・名古屋工業大学
    • Year and Date
      2006-07-14
  • [Presentation] A novel glutathione importer of Escherichia coli K-12 with an ATP-binding cassette.2006

    • Author(s)
      Hideyuki Suzuki
    • Organizer
      20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress
    • Place of Presentation
      京都・京都国際会館
    • Year and Date
      2006-06-22

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Published: 2010-02-04   Modified: 2016-04-21  

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